Vektor Terapi Gen - Lentivirus

1. Struktur genom dan siklus hidup

Lentivirus merupakan anggota subkelas Retrovirus, famili Retroviridae. Lentivirus mempunyai tiga gen utama yang mengkode protein viral, yaitu 5’-gag-pol-env-3’. Protein hasil ekspresi gen pol berupa enzim viral yang terlibat pada awal tahap replikasi adalah reverse transkriptase dan integrase. Reverse transkriptase (RT) merupakan DNA polimerase viral yang bersifat RNA-dependent. Enzim tersebut digunakan oleh genom RNA viral untuk sintesis kopi cDNA. RT juga mempunyai aktivitas RnaseH untuk mendestruksi template RNA (Machida, 2003).

Lentivirus bersifat lebih kompleks dibandingkan Retrovirus, sebab mempunyai 6 jenis protein asesoris, yaitu : Tat, Rev, Vpr, Vpu, Nef, dan Vif. Komposisi gen asesoris berbeda pada setiap tipe Lentivirus tergantung pada produk yang dihasilkan untuk regulasi sintesis dan pemrosesan RNA viral, serta fungsi replikatif yang lain. Adanya protein integrase dan protein Vpr yang terdiri dari sekuen signal berperan penting untuk proses lokalisasi di dalam nukleus. Integrasi virus dengan sel inang melalui protein  Vpr yang berikatan secara langsung dengan kompleks pori nukleus, kemudian protein masuk melalui membran nukleus, menuju nukleus dan melangsungkan reverse transkripsi untuk menghasilkan cDNA. Selanjutnya integrase akan berikatan dengan cDNA viral yang dihasilkan oleh RT dan DNA inang. Aktivitas LTR oleh integrase diawali dengan insersi genom viral ke dalam inang DNA. Walaupun transmisi dihasilkan melalui partikel infektif, namun Lentivirus mampu menginfeksi sel tetangga yang kontak secara langsung dengan sel inang, tanpa membentuk partikel ekstraselluler (Buchschacher et al., 2000).

2. Strategi pembuatan vektor Lentivirus untuk terapi gen

Lentivirus mempunyai kemampuan untuk menginfeksi sel yang berproliferasi maupun tidak berproliferasi. Ekspresi transgen diatur oleh promoter Cytomegalovirus yang direkayasa secara internal dan inaktif. Hal ini dapat menyebabkan respon inflamatori pada saat injeksi vektor ke sel target (Buchschacher, et al., 2000)

Lentivirus mempunyai karakteristik periode inkubasi yang lama. Virus ini mampu mengirimkan sejumlah informasi genetik secara signifikan ke dalam DNA sel inang, sehinggga menjadi salah satu metode yang efisien untuk vektor terapi gen. Beberapa contoh Lentivirus antara lain HIV (Human Immunodeficiency virus), SIV (Simian Immunodeficiency Virus), dan FIV (Feline Immunodeficiency Virus). Vektor lentiviral HIV telah diuji keamanannya, dengan proses penghilangan gen-gen regulatori yang bersifat non-esensial, sehingga terbentuk mutan vpr dan vif yang mampu menginfeksi neuron, sel otot, dan sel hati (Schmidt, 1999).

HIV tipe I (HIV-1), dalam pengembangannya sebagai vektor dan pengemasan cell line  lebih sulit dibandingkan retovirus onkogenik yang lain. Hal ini disebabkan propagasi HIV-1 tidak hanya membutuhkan protein Gag, Pol, dan Env, tetapi juga gen tat dan rev. Pengemasan cell line yang sulit juga disebabkan oleh toksisitas dari HIV-1 yang tinggi. Oleh sebab itu, berbagai vektor HIV-1 dikonstruksi melalui penghilangan gen env pada genom viral, dan menggantinya dengan insert berupa marker gen yang diekspresikan oleh promoter viral heterolog internal. Konstruksi ini menghasilkan ekpresi semua gen HIV, kecuali env, sehingga selubung viral berperan dalam propagasi vektor. Penggunaan glikoprotein selubung HIV memungkinkan vektor ditargetkan pada limfosit T helper, tetapi terbatas pada sel yang tidak dapat terinfeksi dan menghasilkan konsentrasi titer yang rendah.(Anson, 2004)

 Protein selubung viral Retrovirus yang lain mampu menggantikan selubung HIV, antara lain glikoprotein selubung MLV amfotropik atau G-protein virus stomatitis vesikuler (VSV-G) yang mampu menginfeksi berbagai tipe sel. Penggunaan VSV-G juga menghasilkan jumlah vektor yang lebih tinggi dengan kestabilan partikel vektor virus yang lebih tinggi. Kedua virus tersebut merupakan onkoretroviral vektor yang semua gen viralnya (sekuen trans) dihilangkan. Bagian yang tertinggal hanyalah sekuen cis yang penting saja. Gen marker diekspresikan secara langsung dari LTR HIV atau dari promoter internal. Ekspresi gen yang direkayasa dari LTR HIV (contohnya gen tat) memungkinkan ekspresi gen untuk berada pada sel yang mengekpresikan Tat secara spesifik. Namun penggunaan promoter internal meningkatkan tipe sel yang dapat diekspresikan gen marker (Machida, 2003).

Untuk membuat vektor terapi gen lentiviral, gen terapeutik diklon pada sekuen vektor yang dibatasi oleh LTR dan ψ sekuen pada HIV. LTR berperan penting untuk integrasi gen terapeutik ke dalam genom sel traget pada kromosom, seperti LTR dalam HIV berintegrasi dengan kopi DNA untai ganda dari virus. Sekuen ψ berperan sebagai sekuen signal pengemasan RNA dengan gen terapeutik di dalam virion. Protein viral yang membuat selubung virus berperan penting dalam pengemasan cell line. Namun protein ini tidak berada pada sekuen LTR dan sekuen ψ, sehingga tidak terkemas di dalam virion. Akibatnya partikel virus yang dihasilkan mempunyai replikasi yang rendah dan vektor tidak mampu meneruskan infeksi ke inang dan mengekspresikan protein terapeutiknya (Anson, 2004).   

  Vektor Lentivirus sangat berguna untuk mempelajari siklus tunggal replikasi HIV dan mempelajari penyusunan sistem vektor yang lebih baik dibandingkan onkoretroviral. Keuntungan vektor Lentiviral yaitu efisiensi infeksi yang tinggi pada sel yang membelah maupun tidak membelah, ekspresi transgen yang stabil dalam jangka waktu yang lama, dan immunogenisitas yang rendah. Nmun karena tidak terdapat pengemasan cell line untuk  HIV, maka propagasi vektor tergantung pada kotransfeksi vektor dan konstruksi plasmid DNA helper. Sehingga kelemahan vektor ini jumlah titer yang dihasilkan lebih rendah dan meningkatkan resiko untuk membentuk rekombinan virus replikasi-kompeten (Buchschacher, et al., 2000)

Vektor Terapi Gen - Retrovirus

Teknologi terapi gen merupakan salah satu metode untuk menyembuhkan suatu penyakit dengan cara memodifikasi materi genetik suatu sel hidup. Terapi gen melibatkan insersi gen fungsional atau molekul lain kedalam sel untuk mencapai efek terapeutik. Gen yang dimasukkan berupa transgen, dapat dikatakan sebagai suatu obat. Terdapat dua tipe terapi gen, yaitu terapi sel somatik dan sel gamet. Terapi pada sel gamet melalui penyisipan gen yang dilakukan pada saat fertilisasi. Terapi yang sekarang banyak berkembang adalah terapi sel somatik. Tujuan terapi gen adalah mengeliminasi penyakit klinis (somatik) dan gen yang disisipkan menjadikan penyakit pada parental tidak ditularkan pada keturunannya (gametik) (Anson, 2004).

Perkembangan awal teknologi terapi gen didukung oleh beberapa penemuan vektor baik viral maupun non viral untuk membawa transgen yang disisipkan pada sel inang yang sakit. Vektor viral yang sudah dipelajari antara lain virus Moloney Murine Leukimia untuk transfer gen  ke kromosom sel target, terbatas pada sel yang membelah. Selanjutnya penelitian berkembang untuk mencari vektor yang mampu mentransfer gen pada sel yang tidak membelah, antara lain penggunaan virus HIV (Schmidt, 1999). Tulisan ini akan membahas salah satu vektor virus yang digunakan untuk terapi gen, yaitu Retrovirus. 

     Vektor Retrovirus

Retrovirus merupakan virus yang terdapat  pada semua kingdom animalia. Berbagai Retrovirus onkogenik menunjukkan bentuk replikasi defektif yang mengubah sebagian komplemen gen virus normal dengan sekuen onkogenik. Replikasi Retrovirus kompeten yang menyebabkan terjadinya suatu penyakit berhubungan dengan pembelahan yang tidak terkendali dan memberikan kisaran spesies patogenik yang luas. Salah satu penyakit yang  ditularkan secara signifikan antar manusia pada masa kini, yaitu AIDS, disebabkan oleh infeksi  Retrovirus HIV tipe I dan II (Anson, 2004).

 Beberapa jenis Retrovirus mampu menyebabkan infeksi dalam waktu yang lama dan berbeda pada setiap inang. Pada mencit, terdapat beberapa jenis retrovirus yang bersifat onkogenik lemah. Sedangkan pada jenis Retrovirus yang lain yaitu Simian Virus, mempunyai karakteristik seperti HIV-1 yang dapat menjadi agen penyebab AIDS, namun tidak bersifat patogen pada semua inang. Selain itu juga terdapat Retroviral endogenus yang tidak bersifat patologis, contohnya  Spumavirus. Debris dari Retrovirus menunjukkkan berbagai tipe yang berbeda untuk elemen insersional dan mampu berintegrasi secara konstitutif pada genom manusia (Machida, 2003).

Virion Retrovirus berupa partikel sferis, dengan diameter antara 80-100 nm. Stuktur virion dilapisi dengan lipid bilayer yang berasal dari membran plasma sel inang yang disisipi oleh gen retroviral dan menghasilkan produk gen berupa protein selubung. Retrovirus merupakan kelas virus berselubung dan genomnya berupa molekul RNA untai tunggal. Selama infeksi, genom viral Retrovirus melangsungkan  reverse transkripsi membentuk DNA untai ganda., yang berintegrasi dengan genom inang dan diekspresikan sebagai protein viral.

Genom viral berukuran sekitar 10 Kb, terdiri dari 3 gen utama yaitu :

1.    Gen viral gag : mengkode protein utama (core) yang memebentuk virion. Virion terdiri dari dua kopi molekul RNA genomik yang identik (bersifat haploid dan pseudo-diploid),

2.      Gen viral pol : mengkode reverse transkriptase, berupa sebuah tRNA primer

3.      Gen viral env : mengkode protein selubung

               Pada setiap ujung genom viral, terdapat ujung berulang yang panjang (long terminal repeats atau  LTRs) yang mengandung daerah promoter atau enhancer dan sekuen yang terlibat dalam proses integrasi dengan sel inang. Selain itu juga terdapat sekuen yang diperlukan untuk mengemas DNA viral (ψ) dan  daerah pemotongan RNA pada gen env (Anson, 2004).

Berdasarkan fungsi genetiknya, gen pada Retrovirus dibedakan menjadi sekuen cis yang merupakan sisi aktif yang berperan sebagai asam nukleat (mulai dari ujung 5’ LTR). Di bagian dalam  DNA provirus terdapat promoter transkripsional dan RNA (genomik) yang terdiri dari sekuen penting untuk reverse transkripsi genom. Untai pertama untuk sintesis DNA selama proses reverse transkripsi disebut sebagai PBS. Sekuen ψ (psi) berfungsi untuk mengemas RNA genomik menjadi virion. Sedangkan ppt merupakan primer binding site untuk untai DNA yang kedua selama proses reverse transkripsi. Ujung 3’ LTR dalam DNA provirus berfungsi sebagai signal poliadenilasi dan berisi sekuen yang juga berperan penting dalam proses reverse transkripsi. Sedangkan gen trans merupakan sekuen pengkode protein, yaitu gen gagpol yang mengkode poliprotein gag dan pol, serta gen env yang mengkode protein selubung (Machida, 2003). 

Vektor Retroviral yang sering digunakan dalam terapi gen adalah Moloney Murine Leukaemia Virus ( Mo-MLV), yang merupakan virus amfotropik. Virus ini mampu menginfeksi sel tikus sebagai vektor pada hewan model dan menginfeksi manusia sebagai vektor terapi gen. Gen viral Retrovirus (gag, pol, dan env) dapat digantikan oleh transgen yang dikehendaki dan diekspresikan pada plasmid dalam bentuk cell line. Karena gen non esensial kekurangan sekuen pengemasan, maka sekuen ψ tidak termasuk dalam partikel virion. Untuk mencegah rekombinasi yang menghasilkan replikasi retrovirus kompeten, semua daerah homolog vektor harus dihilangkan dan gen non esensial harus diekspresikan paling tidak dalam dua unit transkripsional. Sehingga replikasi Retrovirus kompeten berlangsung pada frekuensi yang rendah (Machida, 2003).

Ekspresi transgen dapat dipacu oleh daerah promoter atau enhancer pada 5’ LTR maupun oleh viral alternatif atau promoter seluler. Analisis mutasi menunjukkan bahwa disekitar sekuen pengkode gag dan sisi upstream dapat dihilangkan tanpa mempengaruhi pengemasan gen viral atau ekspresi transgen. Faktor yang dapat mempengaruhi ekspresi transgen antara lain penempatan start kodon transgen dan perubahan sekuen pada ujung 5’ LTR (Schmidt, 1999).

Untuk membantu identifikasi ekspresi, dapat dimasukkan sel marker selektif yang dapat mengalami transformasi. Ekspresi transgen dapat ditingkatkan dengan penambahan sisi ribosom internal. Kapasitas vektor Retroviral yang tersedia untuk membawa insert gen asing sebesar 7.5 Kb. Jumlah ini terlalu sedikit untuk ukuran transgen maupun cDNA. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan gen env  untuk menambah kapasitas vektor. Selubung Retroviral berinteraksi dengan protein seluler spesifik untuk membedakan kisaran sel target. Proses dilakukan dengan cara memodifikasi secara langsung binding site antara protein selubung dan reseptor seluler yang mempengaruhi internalisasi partikel viral. Sehingga vektor mampu berintegrasi dengan sel inang (Machida, 2003).

Syarat terjadinya integrasi dan ekspresi gen retroviral adalah sel target tersebut harus membelah. Hal ini menjadi faktor pembatas dalam penggunaan vektor retroviral untuk terapi gen. Vektor Retroviral hanya dapat digunakan pada sel yang  berproliferasi secara in vivo maupun secara ex vivo. Sel target harus distimulasi dan ditransduksi terlebih dahulu, sehingga aktivitas membran nukleus dapat memecah selubung protein retrovirus, kemudian dengan bantuan ezim integrase, gen viral masuk ke nukleus dan berintegrasi dengan genom sel target (Anonim, 2005). Dalam produksi virion vektor, proses pengemasan genom dalam sel sangat penting. Pengemasan sel line memerlukan semua protein viral yang dibutuhkan untuk produksi kapsid dan maturasi virion dari vektor. Pengemasan cell line berlangsung karena adanya gen gag, pol, dan env. Pengemasan cell line awal terdiri dari replikasi genom retroviral kompeten dan sebuah rekombinan tunggal antara genom dan vektor DNA retroviral dapat menghasilkan produksi virus wild type. Setelah insersi gen yang dikehendaki ke vektor DNA retroviral dan pengemasan cell line secara benar, preparasi vektor retroviral akan menjadi lebih mudah (Anonim, 2005).

Salah satu permasalahan dalam terapi gen menggunakan retrovirus adalah rendahnya spesifitas insersi enzim integrase dari virus untuk dapat berintegrasi dengan genom sel inang. Apabila materi genetik disisipkan di bagian tengah dari genom inang, dapat menyebabkan terjadinya mutagenesis insersional. Jika gen tersebut bertanggung jawab pada pembelahan sel, maka dapat menyebabkan  pembelahan sel menjadi tidak terkendali. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan zinc finger nuclease atau dengan memasukkan sekuen tertentu seperti daerah kontrol lokus beta-globin untuk  integrasi pada daerah kromosom yang spesifik (Anson, 2004). Selain itu beberapa retrovirus mengandung protoonkogen, yang dapat bermutasi dan menyebabkan kanker. Hal ini harus dihindari dalam penggunaan retrovirus sebagai vektor terapi gen. Retrovirus juga dapat mennyebabkan tansformasi  sel dengan cara berintegrasi dengan protoonkogen seluler dan memacu ekspresi yang tidak dikehendaki dari LTR, atau menghambat ekspresi gen tumor supressor (Machida, 2004).

Kapsulasi Enzim Pemasakan Keju

Peningkatan produktivitas keju, terkait dengan penanganan dan pemasakan (maturasi) keju untuk menghasilkan rasa, aroma dan tekstur yang berkualitas, menjadi parameter yang sangat penting dalam industri pembuatan keju. Kapsulasi enzim protease merupakan salah satu cara untuk mempercepat pemasakan keju. Dalam pembuatan keju, kapsulasi enzim protease melindungi kerusakan enzim dan mencegah penurunan konsentrasi enzim protease pada tahap pemasakan. Penggunan fraksi lemak dengan titik lebur yang tinggi untuk kapsulasi enzim bersifat lebih stabil dan bersesuaian dengan suhu maturasi pada pembuatan keju Cheddar. Selain itu bahan yang dapat digunakan untuk kapsulasi enzim adalah food gum atau senyawa hidrokoloid hidrofilik, yang dalam aplikasinya menunjukkan kemampuan untuk mempercepat pemasakan dalam proses pembuatan keju Cheddar. Food gum mempunyai kemampuan dalam immobilisasi sel hidup dan enzim. Kapsul enzim dari bahan gum dapat dengan mudah dipreparasi, murah, tersedia dalam jumlah banyak, dan mempunyai kompatibilitas biologis yang tinggi, sehingga aman untuk dikonsumsi. Sumber gum yang dapat digunakan untuk kapsulasi enzim protease antara lain gellan dan K-Carageenan. Parameter yang dikaji dalam paparan ini adalah kecepatan pemasakan keju dan dampaknya terhadap rasa, aroma, dan tekstur keju yang dihasilkan. Adapun tahap-tahap yang dilakukan dalam kapsulasi enzim protease untuk mempercepat pemasakan keju dijelaskan sebagai berikut.

1. Preparasi kapsul gum

Metode yang digunakan mengacu pada metode Audet dan Lacroix (1989) dan Arnaud dan Lacroix (1991). Polimer gum dari gellan dan K-Carageenan disuspensikan, kemudian diemulsikan hingga teremulsi sempurna, selanjutnya dicampur dengan Flavourzyme dan dikentalkan hingga membentuk gel.

     2.  Kecepatan kapsulasi enzim
 

Efisiensi kapsulasi enzim protease ditentukan dengan membedakan aktivitas proteolitik enzim, menggunakan substrat berupa kasein. Aktivitas proteolitik enzim ditentukan oleh presipitasi asam amino dan peptida terlarut, sebagai  hasil reaksi antara kasein dengan TCA (asam trikloroasetat).

     3.  Pembuatan keju
 

Keju yang digunakan sebagai kontrol dibuat dengan mengacu pada metode Australian Society of Dairy Technology (1977) dengan menggunakan susu pasteurisasi dan starter Lactococcus lactis dan L. cremoris, serta rennet anak sapi. Kontrol dibandingkan dengan keju yang mendapat perlakuan berupa tambahan enzim protease yang sudah dikapsulasi dengan 3 bahan yang berbeda, yaitu gelllan dan K-carageenan

     4.  Estimasi kapsul enzim dalam dadih keju
 

Retensi kapsul enzim protease dalam dadih keju ditentukan secara tidak langsung melalui pengukuran kuantitas kapsul yang hilang dalam whey keju. Volume total whey keju yang diperoleh selama pembuatan keju dikumpulkan dan disaring dengan saringan stainless steel 120 micron. Kapsul yang didapatkan pada saringan diukur dalam silinder 50ml. Retensi kapsul enzim protease ditunjukkan dengan persentase total volume kapsul yang dihasilkan dalam dadih keju

      5.  Analisis komposisi keju
 

Kandungan lemak keju ditentukan dengan uji Babcock. Kadar air diukur dengan metode pengeringan oven. Total protein ditentukan dengan metode semi-micro Kjeldahl. Kandungan garam NaCl ditentukan dengan metode Volghard, mengacu pada Bartels et al (1987).

     6.  Penentuan aktivitas proteolisis
 

Degradasi kasein selama pemasakan keju dievaluasi setelah 1 hari, 2, 4,8,12, dan 16 minggu dengan menggunakan metode High Performance Capillary Electrophoresis (HPCE). 

     7.  Penentuan kelompok asam amino bebas
 

Proteolisis dalam pemasakan keju diamati dengan pengukuran asam amino bebas menggunakan asam trinitrobenzenesulfonat (TNBS), mengacu pada metode Polychroniadou (1988). Konsentrasi asam amino bebas ditunjukkan dengan konsentrasi glisin dalam mg/ml.

     8.  Profil Tekstur keju
 

Analisis profil tekstur keju mengacu pada metode Raphaelides, Antoniou, dan Petridis (1995) dengan mengamati tingkat kekeringan permukaan blok keju yang terendah.

     9.  Evaluasi sensori
 

Sampel yang dihasilkan diuji oleh panelis untuk mengetahui rasa dan aroma,   mengacu pada metode Muir et al (1995).

 Berdasarkan hasil penelitian Kaisalapathy (2009), kecepatan kapsulasi dari tiap bahan berturut –turut, 48.2% untuk gellan dan 55.6% untuk K-Carageenan. Enzim dengan kapsul gum yang ditambahkan pada susu dalam pembuatan keju mampu meningkatkan kadar air keju lebih tinggi dibandingkan keju kontrol. Degradasi kasein (β) yang diamati dengan metode HPCE menunjukkan semua keju yang diperlakukan dengan enzim terkapsulasi memiliki kecepatan proteolisis yang lebih tinggi dibandingkan dengan keju kontrol, selama periode pemasakan. Tekstur keju dan kualitas sensori tidak berbeda nyata untuk setiap bahan kapsul enzim. Perbedaan tekstur dan kualitas sensori antara keju yang mendapat perlakuan dibandingkan dengan kontrol, menunjukkan hasil yang konsisten dengan  pelepasan enzim protease dari kapsul.

SISTEM IMUN MUKOSA

Sistem imun mukosa merupakan 80% dari semua imunosit tubuh pada orang sehat. Imunitas mukosa merupakan sistem imun innate yang melibatkan netrofil fagositik dan makrofag, sel dendritik, sel NK (natural killer), dan sel mast.  Sel-sel ini terakumulasi di dalam maupun di antara berbagai Mucosa-Assosiated Lymphoid Ttisssue (MALT), yang bergabung membentuk sistem organ limfoid terbesar pada Mammalia. Sel-sel ini berperan dalam eliminasi patogen dan inisisasi respon imun adaptif.

Organ-organ yang terlibat dalam Sistem Imun Mukosa

Organ pertama yang terlibat dalam sistem imun adalah Intestinum. Respon imun pada organ intestinum diawali oleh sel M (microfold cells) yang berlokasi di epitel yang melapisi folikel MALT. Folikel ini berisi sel B, sel T dan antigen-presenting cel (APC) yang dibutuhkan dalam pembentukan respon imun. Sel M bertugas untuk mengambil dan membawa antigen yang berada dalam lumen. Antigen yang berada di dalam lumen organ, akan berinteraksi dengan sel epithelial abortif dan sel epitelial spesifik pada mukosa induktif. Selanjutnya antigen dibawa atau langsung ditangkap oleh APC. APC terdiri dari : sel dendritik (DC), sel limfosit B dan makrofag. Antigen akan dipresentasikan kepada sel T sitolitik  (CD4+) dan T helper (CD8+). Beberapa antigen dapat langsung diproses dan dipresentasikan oleh sel epitelial kepada sel T intraepitelial tetangga (neighboring intraepithelial T cells) meliputi sel T dengan limited resevoire diversity (sel T γδ dan sel NK). Respon imun mukosa dipengaruhi oleh karakteristik antigen, tipe APC yang terlibat dan lingkungan mikro lokal. Untuk antigen yang bersifat non patogen (protein makanan), jalur normal untuk sel dendritik mukosa dan APC lain  melibatkan sel T helper II dan respon berbagai sel T regulator. Mekanisme ini menghasilkan supresi aktif dalam imunitas sistemik.

Organ kedua yang terlibat dalam sistem imun mukosa adalah paru-paru. Sel-sel imun terasosiasi dalam Nose Associated Lymphoid Tissue (NALT), Larynx Associated Lymphoid Tissue (LALT), dan Bronchus Associated Lymphoid Tissue (BALT). Sel APC dalam paru-paru terdiri dari sel dendritik submukosa dan interstitial, serta makrofag alveolus. Makrofag alveolus merupakan 85% sel dalam alveoli, sedangkan sel dendritik hanya 1%. Makrofag alveolus ini merupakan APC yang lebih lemah dibandingkan sel dendritik.  Makrofag alveolus paling banyak terdapat pada alveolus,  terkait dengan peran pentingnya untuk melindungi saluran nafas dari proses inflamasi pada keadaan normal. Pada saat antigen masuk, makrofag alveolus akan mempengaruhi tingkat aktivitas atau maturasi sel dendritik dengan melepaskan sitokin. Sel dendritik akan menangkap antigen, kemudian memindahkannya ke organ limfoid lokal. Setelah melalui proses maturasi, sel dendritik akan memilih limfosit yang spesifik terhadap antigen tersebut dan menginduksi proses imun selanjutnya.

Organ ketiga yang terkait dengan sistem imun mukosa adalah urogenital. Salah satu contoh antigen yang menginfeksi organ urogenital wanita adalah virus herpes simplek (HSV). HSV akan menginduksi mukosa vagina untuk memberikan efek protektif respons imun innate berupa :

(i) sekresi protein, komplemen dan defensin

(ii) respon awal terhadap virus oleh sel epitel dan sel dendritik khas ditandai dengan  produksi interferon, yang selanjutnya mengawali respons imun adaptif

(iii) rekruitmen sel efektor seperti neutrofil, makrofag dan sel NK.

 Peran Sel Dendritik dalam Sistem Imun Mukosa

Sistem imun mukosa melibatkan peran penting sel dendritik. Sel dendritik berada pada jaringan spesifik tubuh, yaitu di hati, plak payeri, mukosa intestinal dan paru-paru. Sel dendritik berperan penting dalam mengontrol aktivasi, pertahanan, dan ekspansi sel regulator dalam sistem imun mukosa. Sel B maupun sel T yang tersensitisasi antigen, akan bergerak melalui kelenjar limfe, masuk ke sirkulasi darah, dan kemudian menempatkan diri pada mukosa terseleksi, yakni pada mukosa yang menjadi tempat untuk berdiferensiasinya sel – sel tersebut menjadi sel plasma dan sel memori, membentuk Imunoglobulin A (IgA) sekretori. Afinitas sel-sel ini dipengaruhi oleh protein integrin pada tempat spesifik (homing reseptors) permukaannya dan reseptor jaringan spesifik komplementer (adressin) pada sel endotel kapiler. Penelitian terbaru menunjukkan bahwa sel dendritik mukosa dapat mempengaruhi ekspresi reseptor homing. Sel dendritik dari plak payeri dan limfonodi mesentrik, (kecuali sel dendritik dari limfa dan perifer) akan meningkatkan ekspresi reseptor homing mukosa α4β7 dan reseptor CCR9, yaitu suatu reseptor untuk aktifasi gut-assosiated chemokine sel T memori dan sel T CD8+ memori pada sel epitel intestinal. terdapat sel dendritik imprinting of gut homing specifity terdiri dari retinoid acid yang diproduksi oleh sel dendritik intestinal tetapi tidak oleh sel dendritik limfoid lain. Hal ini menunjukkan karakteristik sistem imun mukosa yang mampu mengaktifasi sel imun lain pada daerah yang letaknya jauh dari sel imun terinisiasi, melalui imunitas sistemik.

Sekilas Hormon Melatonin

I.                   Penemuan Hormon Melatonin

Hormon melatonin pertama kali didapatkan dari ekstrak glandula pineal sapi oleh McLord dan Allen pada tahun 1917.  Ekstrak dari substansi ini dapat mencerahkan warna kulit pada katak. Selanjutnya pada tahun 1958, Aaron B. Lerner mengkaji struktur kimianya dan memberi nama hormon melatonin. Penelitian ini terus berkembang, hingga pada tahun 1970-an, Lynch et al mempublikasikan adanya pengaruh hormon melatonin dalam membentuk ritme Circadian pada manusia.

II.                Sruktur kimia dan biosintesis hormone melatonin

Hormon melatonin diproduksi oleh pinealosit dalam kelenjar pineal, yang terletak pada pusat otak, tetapi berada diluar blood-brain barrier. Hormon melatonin juga terdapat pada retina mata, lensa mata, kulit, traktus . Gastrointestinalis serta berbagai sel periferal seperti pada sel sumsum tulang, limfosit, dan sel epithel. Pada sel periferal, konsentrasi hormon melatonin lebih tinggi dibandingkan dalam darah, namun aktivitasnya tidak diatur oleh mekanisme fotoperiodik.  Hormon melatonin yang disekresikan dari glandula pineal bersifat sebagai endokrinal, sedangkan dari organ lain bersifat parakrinal. Organ pada manusia yang memproduksi hormon melatonin dalam jumlah terbesar adalah kulit. Dalam sel kulit, hormon melatonin ditemukan bersama produk sampingnya.

Molekul hormon melatonin berupa N-acetyl 5-methoxtryptamine, dan produk sampingnya berupa N(1)-acetyl-N(2)-formyl-5 methoxykynuramine (AFMK). Kedua molekul secara alami disintesis dari asam amino triptofan, melalui sintesis serotonin. Selanjutnya serotonin diubah menjadi melatonin oleh enzim N-asetiltransferase dan 5-hydroxyindole-O-metil transferase.

 Produksi melatonin oleh glandula pineal dipengaruhi oleh Suprachiasmatic Nuklei (SCN) dari kelenjar Hipothalamus yang menerima informasi dari retina, terkait dengan pola gelap dan terang pada siklus harian. Ritme SCN dan produksi melatonin dipengaruhi oleh sinyal cahaya (gelap/terang). Sinyal cahaya mencapai SCN melalui sel ganglion fotosensitif retinal berupa non image forming yang berkeliling melalui traktus retinohipothalamus (RHT) dan berperan sebagai fotoreseptor. Sel ganglion ini berbeda dengan  sel fotosensitif  yang pada umumnya berupa image forming, yaitu sel batang dan sel konus pada retina. Sel ganglion non image forming menyusun 2 % dari total sel ganglion fotosensitif retinal pada manusia dan mengekspresikan fotopigmen melanopsin. Sensitivitas melanopsin sinergi dengan vitamin A dalam hal fotopigmen dengan puncak sensitivitas pada panjang gelombang 484 nm (warna biru terang). Aktivitas fotoperiodik ini menghasilkan produk berupa ambang gelap dan terang yang spesifik untuk menginduksi signal neural dan endokrinal yang mengatur perilaku dan fisiologi ritme circadian. Melatonin disekresikan dalam kondisi kekurangan cahaya, sehingga tingkat sirkulasi hormon melatonin beragam dalam setiap siklus harian

Melatonin juga disintesis oleh beberapa jenis tanaman, antara lain padi. Berdasarkan hasil penelitian, melatonin dari tumbuhan alami yang dicerna menunjukkan kemampuan untuk menemukan dan bergabung dengan hormone melatonin dalam otak mamalia pada binding site.

III.             Fungsi hormon melatonin

Hormon melatonin berperan penting dalan pengaturan ritme Circadian, sistem immune, dan sebagai antioksidan.

A.     Ritme Circadian

Signal hormon melatonin membentuk sistem yang mengatur siklus bangun dan tidur. Secara kimiawi, hormon melatonin menyebabkan rasa kantuk dan menurunkan suhu tubuh. Mekanisme ini bekerjasama dengan komponen parakrin dari sistem saraf pusat, khususnya SCN, dalam mengatur siklus harian. Produksi melatonin oleh glandula pineal dihambat oleh cahaya dan diinduksi oleh gelap (tanpa cahaya), sehingga hormon melatonin sering disebut sebagai darkness hormone. Hormon ini aktif di sore hari, dan disebut sebagai Dim Light Melatonin Onset (DLMO). Sekresi melatonin dan konsentrasinya didalam darah paling tinggi pada tengah malam, kemudian menurun secara gradual pada setiap jamnya. Variasi konsentrasi melatonin berbeda pada setiap individu, berdasarkan Chronotype-nya. Perlakuan over eluminasi dapat mengurangi  konsentrasi melatonin secara signifikan. Cahaya biru bersifat supresif terhadap melatonin. Perlakuan dengan menggunakan google penghalang warna biru dapat mencegah penurunan hormon melatonin dan memberikan efek lebih cepat tidur dalam waktu yang lebih lama.

B.     Sistem immun

Efek immunologis yang positif ditunjukkan oleh adanya afinitas reseptor melatonin yang tinggi, yaitu MT1 dan MT2 yang diekspresikan dalam sel immunokompeten. Melatonin mempunyai kemampuan untuk meningkatkan produksi sitokin sebagai pertahanan dari immunodefisiensi. Melatonin juga berperan dalam melawan penyakit akibat infeksi, baik yang disebabkan oleh virus maupun bakteri. Melatonin endogenous dan limfosit manusia saling berinteraksi dalam  produksi Interleukin-2 (IL-2) dan ekspresi reseptor IL-2.. Hal ini menunjukkan hormon melatonin terlibat dalam mekanisme limfosit T untuk melawan antigen. Pada saat bergabung dengan kalsium, melatonin berperan sebagai immunostimulator.

C.     Antioksidan

Hormon melatonin merupakan molekul antioksidan yang kuat. Penelitian tentang ini berkembang sejak tahun 1993. Melatonin sebagai antioksidan memungkinkan pergerakan melalui membrane sel dan blood brain barrier. Melatonin sebagai ‘pembersih’ ion OH^-, O₂^- dan NO mempunyai mekanisme yang berbeda dengan antioksidan yang lain. Melatonin tidak mengalami siklus redoks, yaitu kemampuan suatu molekul untuk mengalami oksidasi dan reduksi secara berulang-ulang. Melatonin setelah mengoksidasi, tidak dapat direduksi kembali ke bentuk awal, sebab melatonin yang bereaksi dengan radikal bebas membentuk metabolit yang stabil, sehingga disebut sebagai antioksidan terminal. Metabolit pertama yang dihasilkan dalam Melatonin Antioxidant  Pathtway  (MAP) adalah AFMK dan mengekskresikan 6-hidroxymelatonin sulfat. Molekul AFMK mampu menetralisasi 10 ROS/RNS (Rective Oxygen Species/Reactive Nitrogen Species) yang dapat menyebabakan luka pada otak. Pembentukan metabolit dalam proses MAP akan terus berlangsung hingga didapatkan metabolit kuartener dan prosenya secara keseluruhan disebut sebagai Free Radical Scavenging Cascade. Melatonin mampu melindungai kerusakan DNA nuklear dan DNA mitokondrial dari beberapa karsinogen.dengan cara menghentikan mekanisme yang dapat menyebabkan kanker, yaitu menghalangi sekresi hormon yang dapat memacu pertumbuhan sel kanker.

Daftar Pustaka

Arendt J. Melatonin, circadian rhythms and sleep. New Engl J Med; 2000;343(15):1114-1116.

Boutin J, Audinot V, Ferry G, Delagrange P (2005). "Molecular tools to study melatonin pathways and actions". Trends Pharmacol Sci 26 (8): 412–9

http://sciencestage.com/v/12479/melatonin-by-www.biolifestyle.org/en.html

Jamie M. Zeitzer, et al., Journal of Physiology. Sensitivity of the human circadian pacemaker to nocturnal light: Melatonin phase resetting and suppression (2000), 526.3, pp. 695.

Savvidou, O. Official journal of Hellenic Association of Orthopaedic Surgery and Traumatology .  Melatonin The hormone of pineal gland and its relation to circadian rhythms and idiopathic scoliosis.(2006) , Vol : 57.

Gen Pemetabolisme Obat : CYP2C

      Gen pada kromosom yang berada di dalam sel autosom manusia yang bersifat diploid, terdiri dari pasangan alternatif sequen nukleotida yang disebut sebagai alel. Alel satu dibedakan dari alel yang lain berdasarkan perbedaan sekuen nukleotida, sehingga membentuk variasi genetik. Adanya variasi genetik pada setiap individu dapat mempengaruhi struktur dan fungsi protein yang diekspresikan. Adanya ekspresi protein fungsional yang dipengaruhi oleh variasi genetik menjadi kajian dalam farmakogenetik, khususnya ekspresi gen-gen yang terlibat dalam metabolisme obat (Robinson, 2003; Limdi and Veenstra, 2009).

Faktor genetik berpengaruh sebesar 20-95% terhadap variabilitas disposisi obat pada individu, sedangkan sisanya dipengaruhi oleh usia, fungsi organ, kesesuaian terapi, interaksi antar obat, dan karakteristik penyakit. Pada saat obat dikonsumsi, diserap dan didistribusikan pada sisi aksinya, obat akan berinteraksi dengan target (reseptor dan enzim), kemudian diekskresikan. Penelitian di bidang farmakogenetik terkait peran enzim yang berperan pada metabolisme suatu obat, termasuk transpor membran yang mempengaruhi absorbsi, distribusi, dan ekskresi obat berperan penting dalam membantu memprediksi keberhasilan terapi suatu penyakit (Ingelman-Sundberg, 2004).

Variasi gen antar individu dalam respon terhadap obat telah banyak dipelajari, namun kapasitas untuk memprediksi keamanan dan efikasi dosis standar obat masih relatif rendah. Pada umumnya pengobatan standar yang diberikan hanya memberikan efek terapeutik sebesar 50% dari total populasi pasien, sedangkan 50% pasien yang lain mengalami underdosis yang menyebabkan pasien tidak mendapatkan efek terapeutik dari suatu obat secara optimal atau overdosis yang menyebabkan pasien menderita keracunan obat. Hal ini sangat berisiko terutama untuk terapi yang menggunakan obat-obat dengan indeks terapi yang sempit, antara lain obat anti kanker, anti koagulan, dan obat-obat psikoaktif tertentu (Crettol et al., 2010).

Sitokrom P450 atau CYP450 merupakan enzim yang terlibat dalam jalur metabolisme utama untuk senyawa obat dan substansi yang lain. Pengetahuan mengenai substrat, inhibitor, dan inducer enzim CYP450 dan bagaimana satu obat mempengaruhi kinerja obat lain melalui sistem ini dapat membantu prediksi terjadinya efek samping obat yang tidak diinginkan (Adverse Drug Interaction/ADI) yang serius (Ishizaki, 2002). Adanya variasi genetik menyebabkan perbedaan ekspresi enzim CYP450 pada setiap individu, sehingga enzim diekspresikan dalam jumlah yang lebih tinggi atau lebih rendah. Interaksi obat dapat terjadi pada saat dua obat atau lebih yang diregulasi oleh enzim yang sama terjadi secara bersamaan, sehingga terjadi penurunan atau peningkatan aktivitas enzim CYP450 tertentu yang menjadikan metabolisme obat menjadi lebih lambat (poor metabolizer/PM) atau lebih cepat (ultra rapid metabolizer/UM) dibandingkan metabolisme normal (excessive metabolizer/EM). Hal ini berpengaruh terhadap efikasi dan toksisitas obat pada tiap individu (Fieldhouse, 2000; Johnson and Evans, 2002 ).

Enzim CYP450 yang mempengaruhi kecenderungan individu memiliki fenotip pemetabolisme cepat maupun pemetabolisme lambat antara lain termasuk dalam subfamili CYP2C, yaitu CYP2C9 dan CYP2C19. Kedua enzim ini diekspresikan dalam hepar. Enzim CYP2C9 terlibat dalam metabolisme 10 % obat, sedangkan enzim CYP2C19 terlibat dalam metabolisme 20% obat. Prevalensi polimorfisme gen yang mengkode kedua enzim ini pada populasi negara-negara di Asia lebih tinggi dibandingkan gen yang mengkode enzim CYP450 yang lain.

Frekuensi varian kedua gen ini bervariasi pada tingkat populasi ras dan suku yang berbeda. Sebagai contoh, frekuensi varian gen CYP2C9 pada ras kaukasia (Eropa) sekitar 20 %, pada ras negroid (Afrika-Amerika) sekitar 6% (Scordo et al., 2001), dan pada populasi ras oriental (Asia) sebesar 3 % (Yoon et al., 2000 ; Yang et al., 2010), sedangkan frekuensi varian gen CYP2C19 pada ras kaukasia sekitar 6% dan 1% pada ras negroid (Afrika-Amerika). Frekuensi yang lebih tinggi terdapat pada ras Asia dibandingkan kaukasia, yaitu sebesar 19% untuk Jepang, 15 % untuk China, dan 13 % untuk Korea (Sohn, 2002).