Vektor Terapi Gen - Retrovirus

Teknologi terapi gen merupakan salah satu metode untuk menyembuhkan suatu penyakit dengan cara memodifikasi materi genetik suatu sel hidup. Terapi gen melibatkan insersi gen fungsional atau molekul lain kedalam sel untuk mencapai efek terapeutik. Gen yang dimasukkan berupa transgen, dapat dikatakan sebagai suatu obat. Terdapat dua tipe terapi gen, yaitu terapi sel somatik dan sel gamet. Terapi pada sel gamet melalui penyisipan gen yang dilakukan pada saat fertilisasi. Terapi yang sekarang banyak berkembang adalah terapi sel somatik. Tujuan terapi gen adalah mengeliminasi penyakit klinis (somatik) dan gen yang disisipkan menjadikan penyakit pada parental tidak ditularkan pada keturunannya (gametik) (Anson, 2004).

Perkembangan awal teknologi terapi gen didukung oleh beberapa penemuan vektor baik viral maupun non viral untuk membawa transgen yang disisipkan pada sel inang yang sakit. Vektor viral yang sudah dipelajari antara lain virus Moloney Murine Leukimia untuk transfer gen  ke kromosom sel target, terbatas pada sel yang membelah. Selanjutnya penelitian berkembang untuk mencari vektor yang mampu mentransfer gen pada sel yang tidak membelah, antara lain penggunaan virus HIV (Schmidt, 1999). Tulisan ini akan membahas salah satu vektor virus yang digunakan untuk terapi gen, yaitu Retrovirus. 

     Vektor Retrovirus

Retrovirus merupakan virus yang terdapat  pada semua kingdom animalia. Berbagai Retrovirus onkogenik menunjukkan bentuk replikasi defektif yang mengubah sebagian komplemen gen virus normal dengan sekuen onkogenik. Replikasi Retrovirus kompeten yang menyebabkan terjadinya suatu penyakit berhubungan dengan pembelahan yang tidak terkendali dan memberikan kisaran spesies patogenik yang luas. Salah satu penyakit yang  ditularkan secara signifikan antar manusia pada masa kini, yaitu AIDS, disebabkan oleh infeksi  Retrovirus HIV tipe I dan II (Anson, 2004).

 Beberapa jenis Retrovirus mampu menyebabkan infeksi dalam waktu yang lama dan berbeda pada setiap inang. Pada mencit, terdapat beberapa jenis retrovirus yang bersifat onkogenik lemah. Sedangkan pada jenis Retrovirus yang lain yaitu Simian Virus, mempunyai karakteristik seperti HIV-1 yang dapat menjadi agen penyebab AIDS, namun tidak bersifat patogen pada semua inang. Selain itu juga terdapat Retroviral endogenus yang tidak bersifat patologis, contohnya  Spumavirus. Debris dari Retrovirus menunjukkkan berbagai tipe yang berbeda untuk elemen insersional dan mampu berintegrasi secara konstitutif pada genom manusia (Machida, 2003).

Virion Retrovirus berupa partikel sferis, dengan diameter antara 80-100 nm. Stuktur virion dilapisi dengan lipid bilayer yang berasal dari membran plasma sel inang yang disisipi oleh gen retroviral dan menghasilkan produk gen berupa protein selubung. Retrovirus merupakan kelas virus berselubung dan genomnya berupa molekul RNA untai tunggal. Selama infeksi, genom viral Retrovirus melangsungkan  reverse transkripsi membentuk DNA untai ganda., yang berintegrasi dengan genom inang dan diekspresikan sebagai protein viral.

Genom viral berukuran sekitar 10 Kb, terdiri dari 3 gen utama yaitu :

1.    Gen viral gag : mengkode protein utama (core) yang memebentuk virion. Virion terdiri dari dua kopi molekul RNA genomik yang identik (bersifat haploid dan pseudo-diploid),

2.      Gen viral pol : mengkode reverse transkriptase, berupa sebuah tRNA primer

3.      Gen viral env : mengkode protein selubung

               Pada setiap ujung genom viral, terdapat ujung berulang yang panjang (long terminal repeats atau  LTRs) yang mengandung daerah promoter atau enhancer dan sekuen yang terlibat dalam proses integrasi dengan sel inang. Selain itu juga terdapat sekuen yang diperlukan untuk mengemas DNA viral (ψ) dan  daerah pemotongan RNA pada gen env (Anson, 2004).

Berdasarkan fungsi genetiknya, gen pada Retrovirus dibedakan menjadi sekuen cis yang merupakan sisi aktif yang berperan sebagai asam nukleat (mulai dari ujung 5’ LTR). Di bagian dalam  DNA provirus terdapat promoter transkripsional dan RNA (genomik) yang terdiri dari sekuen penting untuk reverse transkripsi genom. Untai pertama untuk sintesis DNA selama proses reverse transkripsi disebut sebagai PBS. Sekuen ψ (psi) berfungsi untuk mengemas RNA genomik menjadi virion. Sedangkan ppt merupakan primer binding site untuk untai DNA yang kedua selama proses reverse transkripsi. Ujung 3’ LTR dalam DNA provirus berfungsi sebagai signal poliadenilasi dan berisi sekuen yang juga berperan penting dalam proses reverse transkripsi. Sedangkan gen trans merupakan sekuen pengkode protein, yaitu gen gagpol yang mengkode poliprotein gag dan pol, serta gen env yang mengkode protein selubung (Machida, 2003). 

Vektor Retroviral yang sering digunakan dalam terapi gen adalah Moloney Murine Leukaemia Virus ( Mo-MLV), yang merupakan virus amfotropik. Virus ini mampu menginfeksi sel tikus sebagai vektor pada hewan model dan menginfeksi manusia sebagai vektor terapi gen. Gen viral Retrovirus (gag, pol, dan env) dapat digantikan oleh transgen yang dikehendaki dan diekspresikan pada plasmid dalam bentuk cell line. Karena gen non esensial kekurangan sekuen pengemasan, maka sekuen ψ tidak termasuk dalam partikel virion. Untuk mencegah rekombinasi yang menghasilkan replikasi retrovirus kompeten, semua daerah homolog vektor harus dihilangkan dan gen non esensial harus diekspresikan paling tidak dalam dua unit transkripsional. Sehingga replikasi Retrovirus kompeten berlangsung pada frekuensi yang rendah (Machida, 2003).

Ekspresi transgen dapat dipacu oleh daerah promoter atau enhancer pada 5’ LTR maupun oleh viral alternatif atau promoter seluler. Analisis mutasi menunjukkan bahwa disekitar sekuen pengkode gag dan sisi upstream dapat dihilangkan tanpa mempengaruhi pengemasan gen viral atau ekspresi transgen. Faktor yang dapat mempengaruhi ekspresi transgen antara lain penempatan start kodon transgen dan perubahan sekuen pada ujung 5’ LTR (Schmidt, 1999).

Untuk membantu identifikasi ekspresi, dapat dimasukkan sel marker selektif yang dapat mengalami transformasi. Ekspresi transgen dapat ditingkatkan dengan penambahan sisi ribosom internal. Kapasitas vektor Retroviral yang tersedia untuk membawa insert gen asing sebesar 7.5 Kb. Jumlah ini terlalu sedikit untuk ukuran transgen maupun cDNA. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan gen env  untuk menambah kapasitas vektor. Selubung Retroviral berinteraksi dengan protein seluler spesifik untuk membedakan kisaran sel target. Proses dilakukan dengan cara memodifikasi secara langsung binding site antara protein selubung dan reseptor seluler yang mempengaruhi internalisasi partikel viral. Sehingga vektor mampu berintegrasi dengan sel inang (Machida, 2003).

Syarat terjadinya integrasi dan ekspresi gen retroviral adalah sel target tersebut harus membelah. Hal ini menjadi faktor pembatas dalam penggunaan vektor retroviral untuk terapi gen. Vektor Retroviral hanya dapat digunakan pada sel yang  berproliferasi secara in vivo maupun secara ex vivo. Sel target harus distimulasi dan ditransduksi terlebih dahulu, sehingga aktivitas membran nukleus dapat memecah selubung protein retrovirus, kemudian dengan bantuan ezim integrase, gen viral masuk ke nukleus dan berintegrasi dengan genom sel target (Anonim, 2005). Dalam produksi virion vektor, proses pengemasan genom dalam sel sangat penting. Pengemasan sel line memerlukan semua protein viral yang dibutuhkan untuk produksi kapsid dan maturasi virion dari vektor. Pengemasan cell line berlangsung karena adanya gen gag, pol, dan env. Pengemasan cell line awal terdiri dari replikasi genom retroviral kompeten dan sebuah rekombinan tunggal antara genom dan vektor DNA retroviral dapat menghasilkan produksi virus wild type. Setelah insersi gen yang dikehendaki ke vektor DNA retroviral dan pengemasan cell line secara benar, preparasi vektor retroviral akan menjadi lebih mudah (Anonim, 2005).

Salah satu permasalahan dalam terapi gen menggunakan retrovirus adalah rendahnya spesifitas insersi enzim integrase dari virus untuk dapat berintegrasi dengan genom sel inang. Apabila materi genetik disisipkan di bagian tengah dari genom inang, dapat menyebabkan terjadinya mutagenesis insersional. Jika gen tersebut bertanggung jawab pada pembelahan sel, maka dapat menyebabkan  pembelahan sel menjadi tidak terkendali. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan zinc finger nuclease atau dengan memasukkan sekuen tertentu seperti daerah kontrol lokus beta-globin untuk  integrasi pada daerah kromosom yang spesifik (Anson, 2004). Selain itu beberapa retrovirus mengandung protoonkogen, yang dapat bermutasi dan menyebabkan kanker. Hal ini harus dihindari dalam penggunaan retrovirus sebagai vektor terapi gen. Retrovirus juga dapat mennyebabkan tansformasi  sel dengan cara berintegrasi dengan protoonkogen seluler dan memacu ekspresi yang tidak dikehendaki dari LTR, atau menghambat ekspresi gen tumor supressor (Machida, 2004).