Potensi miRNA dalam Terapi Biologis

Berikut adalah beberapa contoh potensi miRNA dalam terapi biologis di masa depan :

1)  Terapi autoimun

            Terapi autoimun dapat dilakukan dengan cara memanipulasi ekpresi miRNA yang memiliki potensi dalam menghambat reaksi autoimun tanpa menimbulkan efek samping (Love et al., 2008). Salah satu kasus autoimun dapat disebabkan oleh sel T yang merespon antigen self. Hal ini terjadi akibat pada masa perkembangan, sel T yang tidak lolos seleksi terhadap self-nya (Zehn et al., 2006). Salah satu miRNA yang dapat menekan respon sel T yaitu miR-181a (Li et al., 2007). Memodulasi miRNA-181a dapat mempengaruhi regulasi respon sel T. Dengan mengendalikan ambang batas dari aktivitas sel T melalui miRNA181a  pada  targetnya (mRNA sel-sel T perifer) diharapkan dapat menghambat respon autoimun  dan  juga  tetap menjaga kemampuan respon sel T  terhadap patogen (Zehn et al., 2006).

            Selain miR-181a, miR-155 juga menjadi potensi terapi pada penyakit autoimun yang berhubungan dengan peningkatan atau penurunan respon sel T. Dengan menggunakan miR-155 mimetic diharapkan dapat meningkatkan profil sitokin TH1 dan meningkatkan respon sel T. Atau menggunakan antagomiR terhadap miRNA-155 untuk menekan aktivitas miRNA-155 sehingga meningkatkan profil TH2 dan menurunkan respon sel T (Love et al., 2008).

2) Terapi penyakit infeksius

            Salah satu terapi miRNA pada penyakit infeksius yaitu dengan cara menghambat replikasi virus dengan membuat artificial miRNA (amiRNA) yang sifatnya komplemen terhadap mRNA virus sehingga dapat menghambat sintesis protein yang esensial untuk virus.

            Misalnya pada penghambatan replikasi virus rabies yaitu dengan membuat artificial miRNA yang sifatnya komplemen terhadap mRNA protein N virus rabies. Protein N ini penting untuk melindungi genom RNA virus rabies dari degradasi RNase saat proses replikasi dalam sel. Pada penelitian Israsena et al. (2009), dibuat ssDNA oligo komplementer yang mengkode pre-miRNA dan diklon ke vektor plasmid. Kemudian di dalam plasmid akan ditranskripsi artificial miRNA dengan target mRNA protein N virus rabies. Plasmid kemudian  ditransfeksi ke sel yang di-challenge dengan virus rabies. Hasil penelitian menunjukkan penurunan level mRNA  protein N dan level genom virus rabies pada sel yang ditransfeksi artificial miRNA dibanding kontrol (postitif rabies, tanpa amiRNA). Hal ini menunjukkan manipulasi miRNA (dengan artificial miRNA) berpotensi sebagai terapi terhadap penyakit infeksius akibat virus.

3) Terapi penyakit non infeksius

            Salah satu terapi miRNA pada penyakit non infeksius yang berkembang saat ini yaitu pada terapi penyakit-penyakit neurodegenerasi. Terapi miRNA menggunakan artificial miRNA akan menyebabkan gen silencing pada gen-gen  target yang berperan pada perkembangan kejadian penyakit prinsipnya akan dibuat sekuen gen secara artificial yang akan dimasukkan ke vektor yang cocok untuk membawa sekuen gen, misalnya virus. Vektor virus akan menginfeksi sel target dan melakukan replikasi pada nukleus (misalnya sel syaraf), sekaligus akan mengkode pre-miRNA dan transkripsi miRNA yang akan berikatan pada gen targetnya (mRNA) di sitoplasma, sehingga tidak terjadi translasi protein yang berperan dalam perkembangan kejadian penyakit (Boudreaua dan Davidson, 2010).

Mutasi gen pada miRNA

Kelainan gen pada miRNA dapat terjadi akibat mutasi pada gen pre-miRNA. Mutasi titik pada daerah promoter dapat mempengaruhi ekspresi gen struktural. Mutasi missense atau nonsense pada coding sequence menyebabkan perubahan fungsi protein. Mutasi ini menyebabkan perubahan pada biogenesis miRNA (Jezdzewski et al., 2009; Zhang dan Zeng, 2010), perubahan target mRNA, perubahan sekuen DNA, dan/atau supressi gen secara menyeluruh (Lee et al., 2011).

Salah satu contoh mutasi pada gen miRNA adalah mutasi pre-miRNA 155. miRNA 155 diekpresikan oleh beberapa sel-sel imun seperti sel B, T, dan makrofag (Lee et al., 2011). miRNA 155 memiliki target gen yang mengekspresikan protein PU-1 dan c-Maf yang berperan dalam pengaturan perkembangan sel T dan imunitas bawaan (Wahid et al., 2010). Peningkatan ekspresi miRNA 155 berperan dalam peningkatan respon antibodi, peningkatan profil sitokin TH1 (sel T helper 1) dan peningkatan respon sel T. Penurunan miRNA 155 menyebabkan peningkatan profil TH2 (sel T helper 2) dan penurunan respon sel T (Love et al., 2008). Mutasi pada gen pre-miRNA 155 didaerah sekitar ujung 3-OH’ menyebabkan disintesis miRNA 155. Mutasi ini menyebabkan terjadinya mismatch antara miRNA155 dengan gen yang menjadi targetnya (Lee et al., 2011). Penghambatan miRNA 155 untuk berikatan dengan gen targetnya diprediksi menekan pembentukan antibodi baru serta respon sel T ataupun respon autoantibodi (Love et al., 2008).

Potensi miRNA sebagai terapi biologis masa depan

            Aplikasi miRNA dalam terapi biologis berupa peningkatan atau penurunan aktivitas miRNA. miRNA dapat berperan untuk menghambat translasi protein (dari mRNA) yang berperan dalam perkembangan kejadian penyakit, sehingga miRNA berperan ke arah perbaikan sel. Namun miRNA juga berfungsi dalam menekan protein yang berperan penting untuk menghambat perkembangan kejadian penyakit. Dalam hal ini, miRNA berperan terhadap kerusakan sel.

            Salah satu upaya untuk meningkatkan aktivitas miRNA yaitu dengan memanipulasi ekpresi miRNA melalui artificial miRNA (amiRNA). amiRNA akan berikatan secara komplemen pada target gen mRNA spesifik yang akan di-silencing oleh amiRNA. Salah satu amiRNA yaitu miRNA-mimetic (small RNA sintetik yang mengandung sekuen gen endogenus miRNA) yang dapat meningkatkan aktivitas protein endogenus miRNA. Sedangkan salah satu upaya menurunkan aktivitas miRNA yaitu dengan cara pemberian antagomiR yang merupakan oligonukleotida antisense yang dapat mengikat miRNA secara komplemen sehingga menurunkan aktivitas miRNA (Love et al., 2008).

Mutasi Gen Reseptor Androgen

Androgen merupakan hormon yang berperan penting untuk mengendalikan diferensiasi seksual pria dan menjaga perkembangan fungsi reproduktif pria normal. Mekanisme aksi hormon androgen dimediasi melalui protein spesifik, yaitu  reseptor androgen (RA) yang merupakan anggota subfamili hormon steroid dari faktor transkripsi nuklear. Mutasi RA berdampak klinis terhadap serangkaian kelainan kejantanan berupa insensitivitas androgen sederhana sampai sindrom insensitivitas androgen kompleks (SIAK).

Sama seperti reseptor steroid yang lain, RA dicirikan dengan struktur modulator.  Lebih dari 600 mutasi dalam gen RA menghasilkan domain transaktivasi N-terminal (domain RA yang terbesar) dalam sindrom insensitivitas androgen. Namun kurang dari 15 mutasi RA mengarah ke sindrom insensitivitas androgen. Daerah C-terminal terdiri dari domain pengikatan DNA dan domain pengikatan ligan, serta teridentifikasi adanya mutasi yang berkisar antara 20%-60%.  Kompleks ligan-reseptor berinteraksi secara langsung dengan gen targetnya dan meregulasi transkripsinya untuk memediasi efek androgen. Jumlah yang terbesar dari SIAK disebabkan oleh substitusi nukleotida tunggal atau delesi yang menyebabkan penataan ulang kodon terminasi promoter dan/atau kemudian mutasi frameshift yang membentuk signal untuk berhentinya translasi.

 

Kerusakan gen RA mencegah perkembangan normal dari struktur internal dan eksternal tubuh laki-laki berkariotipe 46,XY. Resistensi akhir organ terhadap androgen didesain sebagai insensitivitas androgen. Dalam gen RA, 4 tipe mutasi yang berbeda terdeteksi dalam DNA dari individu penderita sindrom insensitivitas androgen, yaitu :

1.      Mutasi titik tunggal yang menghasilkan substitusi asam amino dan stop kodon prematur.

2.      Insersi atau delesi nukleotida paling sering menyebabkan frameshift dan terminasi prematur.

3.      Delesi gen keseluruhan atau parsial

4.      Mutasi intronik dalam donor splice atau sisi acceptor yang mempengaruhi pemotongan RNA gen RA.

Sekitar 90% kerusakan molekuler dalam gen RA adalah mutasi basa tunggal, terutama mutasi missense. Pada mutasi titik gen RA, terdapat region sekuen DNA repetitif, yaitu berupa trinukleotida berulang untuk CAG dan GGN yang berasosiasi dengan berbagai tipe kelainan, termasuk SIAK. Mutasi insersi jarang terdapat pada gen RA yang berasosiasi dengan kelainan SIAK.

Penelitian terkini dalam kasus SIAK familial merupakan mutasi gen RA berupa insersi basa ganda pada ekson 4. Penggantian nukleotida ini menyebabkan terminasi prematur pada asam amino 788, sehingga menghilangkan semua domain pengikatan hormon pada protein RA. Penemuan ini mengindikasikan bahwa perubahan struktur domain pengikatan ligan disebabkan insersi nukleotida yang menyebabkan ketidakmampuan RA mengikat androgen. Hasil penelitian tersebut menunjukkan adanya kasus baru berupa mutasi insersi nukleotida yang menyebabkan frameshift dalam kasus SIAK familial. Berdasarkan deteksi pada protein RA pasien SIAK dan ibunya menunjukkan bahwa insersi nukleotida ganda yang pada gen RA yang jarang ditemukan sebelumnya, merupakan penyebab terjadinya SIAK pada pasien probandus dalam penelitian tersebut.

Sebagian besar mutasi gen RA berupa insersi yang menghasilkan frameshift, dan beberapa diantaranya menghasilkan insersi residu asam amino. Penelitian sebelumnya menunjukkan mutasi delesi/insersi pada ekson 5. Sebuah delesi dari 7 pasangan basa diganti oleh insersi dari 11 nukleotida yang menyebabkan duplikasi pada ujung sekuen downstream. Mutasi g. 2640_2646 del AGGATGC/ 2652_2662 ins TTCGCCCCTGA menghasilkan frameshift 9 kodon pada downstream yang menyebabkan adanya signal TGA, sehingga terjadi terminasi prematur. Perubahan nukleotida ini menyebabkan mutasi delesi/insersi pertama dari RA yang mungkin muncul melalui mekanisme miss-pairing shipped-strand. Penelitian sebelumnya mengemukakan bahwa insersi dari residu sistein dalam zinc finger pertama dari domain pengikatan DNA dari RA pada pasien SIAK.

Dalam kasus sindrom insensitivitas androgen yang terpaut kromosom X (individu 46, XY), terdapat bermacam-macam mutasi dalam gen RA yang menghasilkan substitusi asam amino dan domain pengikatan ligan atau DNA, atau menghasilkan stop kodon prematur sehingga mencegah perkembangan normal struktur reproduksi laki-laki. 

Referensi

Rong, H.L., Suzuki, N., Imai, A. 2010. A double nucleotide insertion-induced frame-shift mutation of the androgen receptor gene in a familial complete androgen insensitivity syndrome.  European journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 148 :53-55.