Aplikasi Katalase Ultrastabil

          Isolasi dan produksi suatu enzim dalam skala laboratorium telah dilakukan oleh banyak peneliti di dunia. Penggunaan enzim katalase ultrastabil dapat menurunkan biaya proses bleaching dalam industri sekaligus menjadikan proses ini lebih ramah lingkungan.

Sejak tahun 1980-an, industri tekstil, kertas, dan industri lainnya telah mencoba menggantikan penggunaan klorin sebagai disinfektan ataupun pemutih dengan hidrogen peroksida (H₂O₂). Klorin yang telah digunakan oleh masyarakat industri selama lebih dari seabad ternyata sangat berbahaya, karena menghasilkan zat racun berupa Dioksin yang bersifat menyebabkan kanker (karsinogenik) dan mengacaukan sistem hormon manusia (endocrine disruptor).

Hidrogen peroksida selain digunakan sebagai agen bleaching atau pemutih di industri kertas atau tekstil, juga digunakan untuk melindungi buah dan sayuran segar dari bakteri patogen seperti Salmonella atau E.coli, pasteurisasi produk susu, ataupun digunakan dalam sterilisasi karton pembungkus jus atau susu segar sehingga tak perlu pendinginan.

Hidrogen peroksida bukan merupakan senyawa yang aman bagi manusia. Keberadaan hidrogen peroksida yang merupakan oksidan dapat menyebabkan kondisi dalam sel yang reduktif menjadi oksidatif. Oleh sebab itu penggantian klorin ke hidrogen peroksida hanya mengurangi masalah dan bukan menyelesaikan masalah lingkungan.

Katalase merupakan enzim yang dapat menguraikan hidrogen peroksida yang berbahaya dalam tubuh manusia, menjadi air dan oksigen yang sama sekali tidak berbahaya. Selain itu, enzim ini di dalam tubuh manusia juga menguraikan zat-zat oksidatif lainnya seperti fenol, asam format, maupun alkohol yang juga berbahaya bagi tubuh manusia. Katalase terdapat hampir di semua makhluk hidup. Bagi sel, enzim ini adalah bodyguard yang melindungi bagian dalam sel dari kondisi oksidatif yang bersifat merusak. Industri telah mulai menggunakan katalase untuk menghilangkan hidrogen peroksida yang tersisa dalam limbah bleaching industri. Tetapi katalase konvensional yang dijual sekarang ini mempunyai banyak keterbatasan. Katalase dari Mammalia seperti manusia, sapi, ataupun mikrobia (jamur), hanya aktif pada suhu antara 37-40 derajat celcius. Hal ini terkait dengan organisme sumber katalase berasal yang hanya mampu bertahan hidup pada rentang suhu tersebut. Oleh sebab itu enzim dari organisme-organisme moderat ini tidak cukup ideal untuk proses pengolahan limbah industri yang biasanya memiliki pH dan temperatur tinggi. Sementara enzim konvensional secara alamiah akan rusak pada kondisi ekstrem tersebut.

Proses bleaching dalam industri selama ini telah menyita biaya yang tidak sedikit untuk meringankan beban lingkungan. Penggantian klorin dengan hidrogen peroksida dalam proses bleaching telah memberikan alternatif yang lebih ramah lingkungan, namun tidak lepas dari munculnya masalah baru. Jika toksin yang dihasilkan oleh produk reaksi pemutihan dengan klorin menjadi kendala dalam pengolahan limbahnya, maka penggunaan hidrogen peroksida mengharuskan alternatif pengolahan sampah hidrogen peroksida yang tersisa dengan enzim katalase komersial yang ada.

Penggunaan katalase komersial yang ada memerlukan ekstra biaya yang cukup besar. Sifat enzim katalase konvensional yang rentan terhadap suhu dan pH ekstrim, membuat industri hanya mempunyai dua pilihan. Pertama, menambahkan enzim katalase secara kontinyu ke dalam bak pengelolaan air buangan untuk menggantikan katalase yang rusak selama proses penguraian limbah hidrogen peroksida. Kedua, menurunkan suhu dan pH air limbah ke kondisi yang dapat ditolerir oleh enzim katalase konvensional. Keduanya memerlukan biaya tinggi, energi besar, dan waktu yang lama untuk pengolahan limbah hingga menjadi air murni dan oksigen.

Penggunaan extremozim katalase merupakan alternatif untuk mengatasi permasalahan tersebut. Extremozim katalase akan mendegradasi hidrogen peroksida secara aman sekaligus ekonomis. Limbah air tidak memerlukan perlakuan lanjutan. Enzim katalase ekstremofilik ini sangat stabil pada suhu dan pH tinggi, yang sesuai dengan kondisi limbah bleaching hidrogen peroksida.

Katalase Ekstremofilik

Katalase ekstremofilik  mempunyai half life time atau waktu paruh 330 jam pada suhu 80 derajat celcius, lebih tinggi dibandingkan dengan katalase komersial konvensional yang hanya  mempunyai waktu paruh 15 detik pada suhu yang sama. Dengan kata lain terjadi peningkatan hampir 80.000 kali peningkatan aktivitas enzim dibandingkan dengan katalase konvensional pada suhu yang sama. Ekstremozim ini juga mempunyai waktu paruh 15 hari pada pH 10 dan suhu 70 derajat celcius, sementara enzim katalase dari sumber lainnya hanya 4 jam pada pH sama dan suhu yang lebih rendah (60 derajat celcius). Waktu paruh adalah waktu inkubasi enzim pada suatu suhu atau pH tertentu sampai enzim berkurang keefektifannya sehingga aktivitas enzim tinggal separuh dari semula. Waktu paruh memang biasa digunakan oleh peneliti untuk membandingkan stabilitas enzim.

Para peneliti dari lembaga riset Departemen Energi Amerika Serikat mengisolasi enzim katalase ultrastabil dari mikroba penyuka lingkungan ekstrem (extremophile) yaitu Thermus brockianus yang hidup pada suhu 70 derajat celcius. Ekstremophiles ini sendiri diisolasi dari Taman Nasional Yellow Stone yang selama ini terkenal sebagai habitat ekstremofil. Hingga saat ini masih belum diketahui mengapa enzim ini tahan panas sekaligus tahan kondisi alkali. Sifat tahan panas bisa ditelusuri dari kesukaan Thermus brockianus hidup di lingkungan suhu tinggi. Akan tetapi, mikroba ini juga menyukai habitat dengan pH moderat.

Katalase ultrastabil diimmobilisasi secara kimiawi pada plastic beads seukuran butir pasir. Lalu, plastic beads yang telah berikatan dengan katalase ekstremofilik siap digunakan. salah satu aplikasi katalase ekstremofilik adalah penggunaan dalam filtrasi air limbah proses bleaching yang banyak mengandung senyawa beracun hidrogen peroksida. Enzim ini dimasukkan ke dalam kolom tabung yang digunakan sebagai filter untuk menyaring air buangan proses bleaching dan menguraikan hidrogen peroksida. Melalui proses immobilisasi seperti ini, ekstremozim menjadi lebih stabil, dan reusable. Sehingga penyaringan berulang-ulang untuk volume limbah lainnya dapat dilakukan dan biaya pengelolaan limbah dapat ditekan.

Peran gen T- DNA ORF 8 Ri-plasmid

T- DNA ORF 8 Ri-plasmid tipe cucumorpine Agrobacterium rhizogenes terlibat dalam respon terhadap auksin pada tembakau transgenik (Quartsi et al., 2004)

Berbagai Ri plasmid selain pRi A_4, yang ditemukan pada A. rhizogenes menunjukkan adanya perbedaan organisasi genetik. Pada plasmid pRi 2659 dan pRi 8196, gen T-DNA rol A, rol B, dan rol C (ORFs 10, 11, dan 12) menunjukkan kemampuan untuk menginduksi proliferasi akar. Conserved sequence dari T-DNA Ri  plasmid bukan gen rol, melainkan ORF 8, 13, 13 a dan 14. ORF 13 dan 14 berperan dalam induksi akar (model percobaan menggunakan potongan wortel), dalam kondisi yang tidak mendukung pembentukan akar, yang diinfeksi dengan Agrobacterium pembawa gen rol ABC. Hal ini mengindikasikan bahwa gen selain rol ABC juga esensial untuk menginduksi hairy root, tergantung tipe dan spesies sel inang. ORF 13 dari pRi 8196 dan pRiA4 menyebabkan terjadinya perubahan perkembangan morfologi tembakau transgenik, pada saat diekspresikian dengan promoter CaMV 35S RNA. ORF 8 dari pRi A4 diekspresikan dalam jaringan hairy root tembakau.  Perbandingan sekuen deduksi peptida – asam amino menunjukkan adanya persamaan yang signifikan pada pRi A4 ORF 8 mungkin terlibat dalam respon terhadap auksin, terkait dengan karakteristik protein :

1.  Protein Tms1 yang dikode gen tms 1 dari T-DNA A. tumefaciens dan protein IaaM dari Pseudomonas savastanoi.

2.      Produk rol B A. rhizogenes dan protein yang diduga dikode gen 5 T-DNA A. tumefaciens

IaaM dan Tms I triptofan monooksigenase mengkatalisis reaksi pembentukan indole-3-asetamide (IAM) yang selanjutnya diubah menjadi produk gen tms2 yaitu IaaH. Gen yang mengkode IaaH berlokasi pada T-DNA A. rhizogenes pada genom patogen tumbuhan P. savastanoi. Hal ini menujukkan bahwa gugus N-terminal dari protein ORF 8 berhubungan dengan protein rol B. Rol B menginduksi perubahan respon terhadap auksin dalam jaringan. Kemiripan sekuen ORF 8 diduga terlibat dalam katalisasi pembentukan senyawa auksin yang mirip dengan indole-3 laktat (ILA), sehingga berimplikasi pada perubahan respon terhadap auksin. Produk gen pRiA4 ORF8 mempunyai aktivitas protein triptofan 2-monooksigenase, namun dapat berubah secara kontroversial menjadi tidak mampu mensintesis IAM.

         Kajian tentang pengaruh ORF 8 dari Ri 2659 A. rhizogenes terhadap morfogenesis dan respon jaringan terhadap auksin pada tembakau transgenik dijelaskan sebagai berikut. 

           Terlebih dahulu perlu dilakukan konstruksi plasmid berupa gen Uid A ORF 8, dari pJBORF8 berisi daerah regulator ORF 8 yang difusikan ke gen Uid A dari PB1101-2 untuk membentuk plasmid PJB78-GUS CaMV 35 S RNA (437 bp), yang diamplifikasi dari plasmid pB1121. Selanjutnya plasmid ditransformasikan ke daun tembakau melalui mediasi Agrobacterium strain LBA 4404, germinasi dan kultur jaringan, pengujian akitivitas enzym GUS, pengamatan dengan mikroskop elektron transmisi, dan pencarian homologi.

Hasil penelitian menunjukkan, A. rhizogenes strain cucumopine 2659 hanya membawa T-DNA yang tidak mengandung gen Aux. T-DNA ini mempunyai struktur homologi tinggi, baik pada pRi 8196 T-DNA dan pRi A4 TlDNA. ORF 10, 11, dan 12 (gen rol A, B, C) yang berperan penting untuk menginduksi hairy root, tidak bersifat homolog dalam biosintesis auksin dan tidak menunjukkan karakteristik conserved sequence. ORF 8 merupakan salah satu conserved sequence di antara 3 T-DNA A. rhizogenes yang berbeda.  Hal ini menunjukkan ORF 8 diduga berperan penting untuk menginduksi hairy root secara alami. Protein ORF 8 mempunyai struktur khusus yang mungkin merupakan fusi protein dengan 2 domain. Perbandingan sekuen asam amino menunjukkan bahwa domain C-terminal dari pRi 2659 ORF 8 mempunyai homologi yang signifikan terhadap tms 1 yang dikode oleh T-DNA A. tumefaciens (31.9%). Domain C-terminal menunjukkan FAD binding site, sebagai sebuah karakteristik fungsional dari protein t2m yang mengkatalisis dekarboksilase oksidatif dari triptofan ke IAM. Struktur ini juga terdapat pada protein IaaM P. savastanoi dan ORF 8 dari pRi A4. Protein ORF 8 homolog dengan protein IaaM, mempunyai aktivitas triptofan 2-monooksigenase rendah. Penelitian mengenai produksi IAM dalam tanaman tembakau mengekspresikan ORF 8 dari pRi 2659. T-DNA dari plasmid terdiri dari satu blok dan tidak mempunyai gen Aux (IaaM dan IaaH) yang mengkode sintesis auksin. Hal ini mengarah pada dugaan bahwa ORF 8 berperan penting pada tahap awal biosintesis auksin, sementara konversi IAM ke IAA tergantung pada gen spesies inang. Selanjutnya gen rol T-DNA dari strain cucupomine menstimulasi pertumbuhan akar, sementara pengaruh gen rol dari strain agropine terhadap stimulasi akar teramati pada saat ada auksin eksogenus.

N-terminal dari pRi2659 ORF 8 mirip dengan produk rol B dan T-DNA lain dari beberapa Ti plasmid. Gen pRi 2659 35 S-ORF 8 secara jelas bersifat resisten terhadap konsentrasi auksin pada kecambah tembakau yang menghambat germinasi dan post-germinasi pada wild type.

    Kotiledon kecambah transgenik menunjukkan fenotipe bentuk yang lurus dan lanceolated, namun mampu mengekspresikan enzim beta-glukoronidase (GUS). Hal ini juga mengindikasikan bahwa transkripsi ORF 8 menginduksi auksin.

Peran gen rol Agrobacterium rhizogenes dalam transgenik tanaman

(Maurel et al., 1991)
 
Bakteri tanah Agrobacterium rhizogenes mampu menginduksi penyakit hairy root pada akar tanaman melalui transfer fragmen DNA (Ri T-DNA) yang terdapat pada plasmid inducing root (pRi). Proliferasi  tunas akar pada sisi terinfeksi menunjukkan ekspresi gen Ri T-DNA memberikan efek seperti auksin _{(auxin-like effect}). Gen biosintesis auksin telah diidentifikasi berada pada T_R-DNA strain agropine (A₄). Beberapa penelitian menunjukkan, A. rhizogenes pada pertumbuhan akar tembakau transgenik bersifat lebih sensitive terhadap auksin, dibandingkan dengan tembakau normal. Hal ini menunjukkan bahwa gen Ri T-DNA menginduksi proliferasi  dari sel akar yang mengalami transformasi. Gen dari pRi A₄ T-DNA yang bertanggung jawab terhadap induksi hairy root pada tembakau adalah rol A, B, dan C. Masing-masing gen mampu memodifikasi sendiri perkembangan tanaman tembakau. Gen rol A dan B berperan penting dalam menginduksi transformasi sel akar menjadi abnormal. Berdasarkan hasil former test, gen tunggal rol meningkatkan sensitivitas protoplast mesofil terhadap auksin.

Dalam artikel ini dikaji mengenai perbandingan sensitivitas akar tanaman tembakau normal dengan tembakau transgenik yang mengalami transformasi T-DNA dari pRi A₄ yang melibatkan tiga gen , yaitu rol A, B, dan C. Selain itu dikaji pula perbedaan potensial transmembran protoplast dan pembelahan sel.

Auksin berpengaruh terhadap morfologi akar tembakau transgenik berupa elongasi dan ekstrusi H⁺ pada ujung akar yang menampakkan hairy root. Peningkatan sensitivitas juga ditunjukkan pada tingkat seluler melalui protoplast hairy root pada respon elektrik terhadap auksin. Auksin menginduksi hiperpolarisasi yang diukur pada protoplast mesofil tembakau. Nilai Em yang rendah dari protoplast  dan amplitudo yang juga rendah dalam respon auksin pada protoplast akar, seperti dalam penelitian terhadap Catharantus roseus, meningkatkan polarisasi inisial protoplast dan intensitas respon auksin.

Peningkatan tunas rhizogenesis dalam tembakau oleh gen rol tunggal menunjukkan efisiensi gen B > A > C melalui percobaan inokulasi daun. Klasifikasi analog ditentukan berdasarkan pengaruh gen rol terhadap sensitivitas auksin terhadap respon elektrik protoplast mesofil. Korelasi antara kapasitas pembentukan akar dan sensitivitas terhadap auksin protoplast diamati dengan menggunakan model tanaman tembakau non rooting auxin-resistant. Kenaikan sensitivitas terhadap auksin dari sel yang ditrasformasi A. rhizogenes menjadikan kenaikan kapasitas pembentukan akar.

Pengaruh kuantitatif perbedaan gen rol pada protoplast terhadap sensitivitas auksin dan pada rhizogenesis, mungkin menunjukkan perbedaan tingkat ekspresi gen. Regulasi promoter rol pada protoplast mesofil tembakau  menunjukkan, adanya molekul NAA mengoptimalkan ekspresi rol B. Sensitivitas dari auksin pada protoplast rol B-transformed berkorelasi dengan ekspresi rol B. Peran tingkat ekspresi gen rol juga ditunjukkan dengan perbedaan sensitivitas auksin antara protoplast yang mengekpresikan protein rol C, dengan menggunakan kontrol rol C  atau promoter 35SCaMV. Sensitivitas hormonal dari rol C lebih rendah dari peran rol B, sehingga prduk gen rol punya potensi yang berbeda terhadap sensitivitas auksin.

Pengaruh pleiotropik dari salah satu gen rol pada beberapa fungsi seluler menyebabkan sensitivitas terhahadap auksin, sehingga berimplikasi pada morfogenesis. Penerimaan dan transduksi signal auksin dapat mempengaruhi respon auksin dalam jangka pendek (< 2 menit) atau jangka panjang (24 jam) untuk membentuk hairy root. Protoplast Ri-transformed mungkin menaikkan jumlah sisi plasmalemma yang dikenali antibodi  untuk bersaing dengan auksin-binding protein.

Berlawanan dengan pengaruh sensitivitas auksin pada respon elektrik protoplast, keseluruhan Ri T-DNA, hanya gen rol B yang mengekspresikan gen CaMV-C dan tidak memodifikasi pembelahan sel sebagai respon hormon. Auksin mengendalikan pembelahan sel dalam jangka panjang dan mekanismenya tergantung pada metabolisme auksin Hasil perbandingan sel yang ditrasformasikan Ri berbeda dengan perbandingan antara tembakau mutan yang resisten auksin dengan wild type. Auksin menginduksi hiperpolarisasi protoplast dan pembelahan sel, hal ini mengindikasikan mutan mengalami pengurangan sensitivitas terhadap auksin. Hasil ini menunjukkan adanya reseptor yang sama yang terlibat dalam respon permukaan sel jangka pendek dan pembelahan sel jangka panjang. Adanya perbedaan jalur penerimaan transduksi auksin, berimplikasi dalam peran auksin untuk mengendalikan pembelahan sel dan elongasi sel, serta rhizogenesis. Berbagai binding site untuk auksin yang menggambarkan karakterisasi fungsional masih belum diketahui.

Selektivitas gen rol yang mempengaruhi respon auksin mungkin berperan dalam kesesuaian transformasi Ri dengan perkembangan tanamanan secara keseluruhan. Gen rol B meningkatkan sensitivitas auksin protoplast 10⁴ kali pada wild type, tetapi tanaman mutan gen rol B berkembang dengan normal selama morfogenesis. Perubahan fenotipe yang disebabkan transformasi tembakau dengan CaMV-B menunjukkan kontrol ekspresi gen rol B yang baik sangatlah penting. Viabilitas tanaman dapat dijelaskan melalui pengendalian auksin dalam pembelahan sel. Adanya proses morfogenesis yang normal, dapat menunjukkan fungsi gen rol B yang efektif. Sehingga dapat disimpulkan bahwa mutasi gen mempengaruhi respon seluler pada fitohormon. Adanya gen rol tunggal A. rhizogenes T_L-DNA mampu meningkatkan sensitivitas protoplast terhadap auksin  

Penggunaan Agrobacterium dalam transgenik tanaman

Mutagenesis insersi T-DNA merupakan salah satu metode yang digunakan untuk menghasilkan tanaman transgenik . T- DNA merupakan elemen insersi spesifik yang ditransfer oleh bakteri Agrobacterium ke dalam tanaman. T-DNA ditransport ke dalam nukleus tanaman inang dan berintegrasi secara stabil dalam genom nuklear tanaman. Proses transfer T-DNA dimediasi oleh gen bakteri yang berlokasi pada region virulensi dalam vektor berupa plasmid. Gen virulen diregulasi oleh sistem regulatori-sensori kimia kompleks yang mampu mengenal metabolit tanaman yang diproduksi selama sintesis dinding sel lignin. Sintesis lignin yang diinduksi luka pada tanaman tidak hanya menyediakan jalan masuk secara fisik untuk Agrobacterium, tetapi juga menginduksi ekspresi gen virulen bakteri. Insersi T-DNA pada genom tumbuhan dapat digunakan untuk menginduksi fusi gen dan mutasi gen insersional, sehingga dapat digunakan untuk identifikasi dan karakterisasi fungsional dari berbagai gen tanaman

Spesies Agrobacterium yang sering digunakan dalam teknologi transfer genetik (trangenik) pada tanaman  adalah Agrobacterium tumefaciens dan Agrobacterium  rhizogenes. Bakteri  A. tumefaciens merupakan penyebab penyakit crown-gall pada tanaman, sedangkan A. rhizogenes merupakan penyebab penyakit hairy root pada akar tanaman. Patogenisitas dan virulensi Agrobacterium terhadap tanaman inang melibatkan adanya plamid yang ditransfer Agrobacterium pada saat menginfeksi tanaman. Plasmid yang menginduksi tumor pada A. tumefaciens disebut sebagai Ti Plasmid, sedangkan plasmid yang menginduksi hairy root pada akar tanaman disebut sebagai Ri plasmid. Beberapa gen yang dikode Ri plasmid bertanggung jawab terhadap modifikasi faktor pertumbuhan tanaman, antara lain hormon auksin. Regulasi ekspresi gen T-DNA Ri plasmid dapat merubah diferensiasi normal sel tumbuhan, dan menyebabkan terjadinya proliferasi pada akar. Gen T-DNA dari Ri plasmid juga mempengaruhi sintesis asam amino dan gula derivatif yang secara spesifik dikenali dan dikatabolisasi oleh A. rhizogenes.

Semliki Forest Virus sebagai vektor terapi gen

1. Struktur genom dan siklus hidup

Virus Semliki Forest (SFV) merupakan anggota genus Alphavirus, famili Togaviridae. Virus ini menginfeksi hewan-hewan vertebrata dan melangsungkan replikasi pada sitoplasma sel inang yang diinfeksi. Virus ini dicirikan dengan genom RNA positif untai tunggal, yang tersusun dari 12.000 nukleotida. Genom tersusun dari ujung 5’ (capped) dan poliadenilasi pada ujung 3’. Genom virus ini secara langsung berperan sebagai mRNA yang mengkode protein polisistronik yang membelah menjadi 4 protein non struktural (nsP1-4). Protein ini berasosiasi dengan faktor seluler dan membentuk kompleks replikase. Kompleks ini memediasi replikasi genom dengan mengubah untai positif menjadi untai negatif yang sangat panjang dan efisien untuk menghasilkan RNA genomik yang baru dan subgenom RNA yang kedua dalam proses autokatalitik. Subgenom RNA mengkode protein struktural yang menjadi prekursor nukleokapsid. Replikasi virus ini sangat efisien, yaitu mencapai 10⁵ virion per sel, dengan dibantu oleh perangkat replikasi dari sel inang (Machida, 2003).

2. Strategi pembuatan vektor SFV untuk terapi gen                

Pada pembentukan protein rekombinan SFV, gen viral yang bersifat struktural diganti oleh transgen. Setelah transfeksi atau elektroporasi ke sel traget, molekul RNA bereplikasi dan memproduksi protein rekombinan dalam jumlah yang banyak. Sistem SFV rekombinan juga termasuk konstruksi tambahan yang menyediakan protein struktural in trans, yang memfasilitasi produksi rekombinan partikel virus untuk transfer gen yang lebih efisien (Lundstorm et al., 2001).

Tahap pembuatan vektor SFV untuk terapi gen menurut Machida (2003) meliputi :

1.      Pembuatan plasmid rekombinan SFV

Vektor plasmid pSFV1 dan pSFV3 yang terdiri dari multiple cloning site minimal, dengan sisi pemotongan enzim restriksi Sma I, Xma I, dan Bam H1. Template Plasmid dilinearkan dengan Spe I sebelum sintesis RNA.

2.      Sintesis RNA SFV

Untuk menghasilkan virus transgen SFV rekombinan, 2 RNA SFV yaitu transgen SFV dan SFV-helper 2 harus disintesis secara in vitro menggunakan plasmid sebagai template. Sintesis RNA menggunakan RNA polimerase SP6 dan menghasilkan RNA dengan ujung 5’, seperti mRNA di dalam sel inang. Karena transkripsi oleh SP6 polimerase menghentikan sintesis, maka template plasmid harus dilinearkan dengan terminasi 3’RNA terlebih dahulu.

3.      Pembentukan Virion SFV

Virion SFV diproduksi dalam sel BHK-21, menggunakan elektroporasi simultan dari transgen SFV dan SFV-helper 2. Produksi selama 24 jam menghasilkan virion dengan kondisi inaktif karena modifikasi protein kapsidnya dan menjadi aktif dengan perlakuan kimotripsin

4.      Titrasi stok SFV

Apabila vektor mengandung gen marker yang dapat dideteksi, seperti lac Z atau GFP, vektor dapat dititrasi melalui transduksi sel BHK-21 dengan seri pengenceran virus melalui warna biru pada sel setelah pengecatan XC-gal (lac Z)atau adanaya fluoresen pada flow sitometer (GFP). Apabila vektor tidak membawa marker gen yang dapat dideteksi, titer virus dibedakan dengan metode dot-blot virion utuh dan memebutuhkan jumlah titer yang lebih banyak. Pada saat hibridisasi signal dari strok SFP yang dihasilkan dibandingkan dengan stok refereansi, maka titer atau jumlah genom RNA dapat diperkirakan.

5.      Transduksi Rekombinan  virus SFV ke sel target

Sel target ditumbuhkan dalam medium pertumbuhan yang sesuai. Virus transgen SFV diaktivasi dengan penambahan kimotripsin, CaCl₂, kemudian diinkubasikan. Protease virus diinaktivasi dengan Aprotinin, kemudian disimpan dalam es. Selanjutnya sel target dipisahkan dari medium dan dicuci dengan PBS yang mengandung ion Mg dan Ca. Kemudian virus rekombinan dimasukkan dalam plate sel target hingga hampir menutupi permukaan sel dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37^oC. Selanjutnya dilakukan analisis ekspresi transgen. 

     3. Potensi SFV sebagai vektor terapi gen

SFV sebagai anggota dari Alphavirus berpotensi sebagai vektor virus terapi gen. SFP mempunyai kisaran inang yang luas, mampu bereplikasi secara efisien di dalam sitoplasma sel inang, mempunyai kapasitas gen yang dapat disisipkan sebesar 5 Kb, dan kemampuan menghasilkan protein rekombinan dalam jumlah banyak. SFV  mempunyai tingkat ekspresi transgen yang cepat, ekspresi temporal, dan destruksi sel target yang dapat dikendalikan. Stok partikel virus yang digunakan untuk menginfeksi kultur cell line dapat diaplikasikan secara in vivo tanpa purifikasi.. Namun untuk ekspresi jangka panjang, penggunaan SFV kurang sesuai sebab data hibridisasi in situ menunjukkan adanya perubahan karakteristik ekspresi gen (Piver et al., 2004).

Vektor Terapi Gen - Lentivirus

1. Struktur genom dan siklus hidup

Lentivirus merupakan anggota subkelas Retrovirus, famili Retroviridae. Lentivirus mempunyai tiga gen utama yang mengkode protein viral, yaitu 5’-gag-pol-env-3’. Protein hasil ekspresi gen pol berupa enzim viral yang terlibat pada awal tahap replikasi adalah reverse transkriptase dan integrase. Reverse transkriptase (RT) merupakan DNA polimerase viral yang bersifat RNA-dependent. Enzim tersebut digunakan oleh genom RNA viral untuk sintesis kopi cDNA. RT juga mempunyai aktivitas RnaseH untuk mendestruksi template RNA (Machida, 2003).

Lentivirus bersifat lebih kompleks dibandingkan Retrovirus, sebab mempunyai 6 jenis protein asesoris, yaitu : Tat, Rev, Vpr, Vpu, Nef, dan Vif. Komposisi gen asesoris berbeda pada setiap tipe Lentivirus tergantung pada produk yang dihasilkan untuk regulasi sintesis dan pemrosesan RNA viral, serta fungsi replikatif yang lain. Adanya protein integrase dan protein Vpr yang terdiri dari sekuen signal berperan penting untuk proses lokalisasi di dalam nukleus. Integrasi virus dengan sel inang melalui protein  Vpr yang berikatan secara langsung dengan kompleks pori nukleus, kemudian protein masuk melalui membran nukleus, menuju nukleus dan melangsungkan reverse transkripsi untuk menghasilkan cDNA. Selanjutnya integrase akan berikatan dengan cDNA viral yang dihasilkan oleh RT dan DNA inang. Aktivitas LTR oleh integrase diawali dengan insersi genom viral ke dalam inang DNA. Walaupun transmisi dihasilkan melalui partikel infektif, namun Lentivirus mampu menginfeksi sel tetangga yang kontak secara langsung dengan sel inang, tanpa membentuk partikel ekstraselluler (Buchschacher et al., 2000).

2. Strategi pembuatan vektor Lentivirus untuk terapi gen

Lentivirus mempunyai kemampuan untuk menginfeksi sel yang berproliferasi maupun tidak berproliferasi. Ekspresi transgen diatur oleh promoter Cytomegalovirus yang direkayasa secara internal dan inaktif. Hal ini dapat menyebabkan respon inflamatori pada saat injeksi vektor ke sel target (Buchschacher, et al., 2000)

Lentivirus mempunyai karakteristik periode inkubasi yang lama. Virus ini mampu mengirimkan sejumlah informasi genetik secara signifikan ke dalam DNA sel inang, sehinggga menjadi salah satu metode yang efisien untuk vektor terapi gen. Beberapa contoh Lentivirus antara lain HIV (Human Immunodeficiency virus), SIV (Simian Immunodeficiency Virus), dan FIV (Feline Immunodeficiency Virus). Vektor lentiviral HIV telah diuji keamanannya, dengan proses penghilangan gen-gen regulatori yang bersifat non-esensial, sehingga terbentuk mutan vpr dan vif yang mampu menginfeksi neuron, sel otot, dan sel hati (Schmidt, 1999).

HIV tipe I (HIV-1), dalam pengembangannya sebagai vektor dan pengemasan cell line  lebih sulit dibandingkan retovirus onkogenik yang lain. Hal ini disebabkan propagasi HIV-1 tidak hanya membutuhkan protein Gag, Pol, dan Env, tetapi juga gen tat dan rev. Pengemasan cell line yang sulit juga disebabkan oleh toksisitas dari HIV-1 yang tinggi. Oleh sebab itu, berbagai vektor HIV-1 dikonstruksi melalui penghilangan gen env pada genom viral, dan menggantinya dengan insert berupa marker gen yang diekspresikan oleh promoter viral heterolog internal. Konstruksi ini menghasilkan ekpresi semua gen HIV, kecuali env, sehingga selubung viral berperan dalam propagasi vektor. Penggunaan glikoprotein selubung HIV memungkinkan vektor ditargetkan pada limfosit T helper, tetapi terbatas pada sel yang tidak dapat terinfeksi dan menghasilkan konsentrasi titer yang rendah.(Anson, 2004)

 Protein selubung viral Retrovirus yang lain mampu menggantikan selubung HIV, antara lain glikoprotein selubung MLV amfotropik atau G-protein virus stomatitis vesikuler (VSV-G) yang mampu menginfeksi berbagai tipe sel. Penggunaan VSV-G juga menghasilkan jumlah vektor yang lebih tinggi dengan kestabilan partikel vektor virus yang lebih tinggi. Kedua virus tersebut merupakan onkoretroviral vektor yang semua gen viralnya (sekuen trans) dihilangkan. Bagian yang tertinggal hanyalah sekuen cis yang penting saja. Gen marker diekspresikan secara langsung dari LTR HIV atau dari promoter internal. Ekspresi gen yang direkayasa dari LTR HIV (contohnya gen tat) memungkinkan ekspresi gen untuk berada pada sel yang mengekpresikan Tat secara spesifik. Namun penggunaan promoter internal meningkatkan tipe sel yang dapat diekspresikan gen marker (Machida, 2003).

Untuk membuat vektor terapi gen lentiviral, gen terapeutik diklon pada sekuen vektor yang dibatasi oleh LTR dan ψ sekuen pada HIV. LTR berperan penting untuk integrasi gen terapeutik ke dalam genom sel traget pada kromosom, seperti LTR dalam HIV berintegrasi dengan kopi DNA untai ganda dari virus. Sekuen ψ berperan sebagai sekuen signal pengemasan RNA dengan gen terapeutik di dalam virion. Protein viral yang membuat selubung virus berperan penting dalam pengemasan cell line. Namun protein ini tidak berada pada sekuen LTR dan sekuen ψ, sehingga tidak terkemas di dalam virion. Akibatnya partikel virus yang dihasilkan mempunyai replikasi yang rendah dan vektor tidak mampu meneruskan infeksi ke inang dan mengekspresikan protein terapeutiknya (Anson, 2004).   

  Vektor Lentivirus sangat berguna untuk mempelajari siklus tunggal replikasi HIV dan mempelajari penyusunan sistem vektor yang lebih baik dibandingkan onkoretroviral. Keuntungan vektor Lentiviral yaitu efisiensi infeksi yang tinggi pada sel yang membelah maupun tidak membelah, ekspresi transgen yang stabil dalam jangka waktu yang lama, dan immunogenisitas yang rendah. Nmun karena tidak terdapat pengemasan cell line untuk  HIV, maka propagasi vektor tergantung pada kotransfeksi vektor dan konstruksi plasmid DNA helper. Sehingga kelemahan vektor ini jumlah titer yang dihasilkan lebih rendah dan meningkatkan resiko untuk membentuk rekombinan virus replikasi-kompeten (Buchschacher, et al., 2000)