Replikasi DNA Adenovirus

Struktur genom dan replikasi Adenovirus secara umum dapat dijelaskan sebagai berikut.

 

1. Genom Adenovirus

Struktur genom pada Adenovirus berbentuk linear, tidak bersegmen, double stranded DNA, dan berukuran 30-38 kbp (ukuran bervariasi antara grup satu dengan yang lain) yang mengkode 30-40 macam gen. Struktur genom merupakan salah satu karakter yang digunakan untuk membedakan grup virus, terkait dengan hibridisasi silang dan peta restriksi (homologi 70-95 % dalam grup yang sama, dan homologi 5-20 % diantara grup).

Sekuen terminal dari setiap untai berulang terbalik, sehingga untai tunggal yang terdenaturasi dapat membentuk  struktur seperti tangkai panci (looping). Pada ujung 5’ setiap untai DNA, terdapat protein dengan berat molekul 55 kD yang melekat secara kovalen.

2. Replikasi

Proses replikasi pada Adenovirus berlangsung di nukleus. Replikasi dibedakan menjadi early dan late phase. Pembagian ini merupakan karakteristik replikasi virus DNA. Perlekatan virus ke sel inang berlangsung lambat, dan terkadang membutuhkan waktu beberapa jam untuk mencapai optimum. Partikel Adenovirus masuk ke dalam sel melalui 2 tahap, yang pertama melibatkan interaksi awal dari protein fiber dengan reseptor seluler, yaitu molekul MHC kelas I dan reseptor Adenovirus – coxsackievirus. Selanjutnya Penton base protein berikatan dengan integrin dari permukaan sel heterodimer yang memungkinkan internalisasi melalui reseptor endositosis. Pada umumnya sel mengekspresikan reseptor primer dengan protein fiber  pada selubung Adenovirus, namun beberapa terjadi secara internal. Oleh sebab itu terdapat fleksibilitas dalam pengaturan pengenalan sel inang oleh virus. Proses secara rinci dijabarkan sebagai berikut.

1. Penetrasi

Proses ini melibatkan fagositosis dalam vakuola fagositik, yang terjadi setelah aktivitas toksik dari penton untuk memecah membran fagositik dan melepaskan partikel ke dalam sitoplasma. Pelepasan selubung akan memacu ekspresi sequen yang bersangkutan. Pada awalnya penton akan melepasakan sebagian partikel tanpa selubung, berbentuk sferik ke sitoplasama. Partikel ini bermigrasi ke nukleus, kemudian bagian dari partikel akan masuk melalui pori nuklear, yang selanjutnya akan berubah menjadi kompleks DNA virus-histon sel inang.

2. Ekspresi gen

Pada awal replikasi genom, mRNA pada early gen dan immediate early  gen ditranskrip secara independen dari DNA yang masuk. Transkripsi genom Adenovirus diatur oleh virus yang dikode faktor pengaturan trans-acting. Produk dari gen immediate early mengatur ekspresi early gen. Early gen dikode pada berbagai lokasi dari kedua untai DNA (l : untai kiri dan r : untai kanan). Berbagai protein dihasilkan dari setiap gen melalui splicing alternatif dari transkripsi mRNA, seperti disajikan pada Tabel 1.

Tabel 1. Trans aktivasi protein Adenovirus

Fase	Gen yang ditranskripsi
Immediate early	E1A
Early	E1B, E2A, E2B, E3, E4, beberapa protein virion
Late	Late gen, hampir semua protein virion

Protein atau mRNA yang pertama kali disintesis setelah 1 jam infeksi adalah E1A. Protein ini merupakan faktor regulasi transkripsional yang ketepatan pola aksinya belum banyak diketahui (bukan faktor transkripsi berupa DNA binding), namun protein ini berperan penting dalam aktivasi transkripsi early gen. Protein ini juga mampu mengaktivasi transkripsi dari berbagai promoter viral dan seluler yang lain, serta tidak menunjukkan adanya spesifisitas sekuen, lebih dipengaruhi oleh modifikasi lingkungan seluler.

Protein kedua yang dibuat adalah EIB. Protein EIA dan EIB bersama-sama (bersifat independen terhadap protein lain) mampu mentransformasi sel primer secara in vitro, terutama pada Ad 5 dan Ad 12.

3. Tranformasi

Proses ini merupakan perubahan morfologi, biokimiawi, atau parameter pertumbuhan pada sel yang dapat mengarah ke pembentukan sel tumor pada hewan model (transformasi neoplastik).  Aktivitas protein E1A dan E1B terkait erat dengan proses transformasi sel. Protein E1A mampu menyebabkan sel primer in vitro tetap hidup, sedangkan protein E1B bekerjasama dengan protein E1A menstabilkan sel yang mengalami transformasi. Sehingga adanya protein E1A dan E2B bersama-sama berperan penting untuk transformasi secara penuh dalam formasi tumor pada hewan.

Terdapat 3 conserved domain yang telah diidentifikasi pada gen AdE1A manusia, yaitu CR1, CR2, dan CR3. Fungsi dari masing-masing domain telah dipelajari melalui analisis mutasional. Mutan CR1 yang berkomplemen dengan mutasi CR2, menunjukkan fungsi diskret domain yang beraksi dalam penggantian sel inang. CR1 terlibat dalam pengikatan fosfoprotein seluler, yaitu p300/CPB, yang merupakan koaktivator transkripsional dengan aktivitas histon asetiltransferase intrinsik.

Mutan E1A yang gagal untuk mengikat p300 juga gagal untuk menstimulasi sintesis DNA seluler dalam sel yang ’istirahat’ dan menyebabkan kematian sel dalam kultur. Segmen CR1 yang berada di antara residu 40-60 membentuk bindig site untuk kepekaan protein retinoblastoma (pRb) dan protein terkait, yaitu p107 dan p130 dalam membentuk kompleks dengan faktor transkripsi, E2F, yang diinduksi oleh E1A untuk mengaktifkan transkripsi E2F. Ekspresi E2F dapat menstimulasi sintesis DNA dalam sel yang ’istirahat’. Selain itu terdapat protein pengontrol siklus sel pada inang, yaitu cyclin A yang berikatan dengan CR2. Protein E1A dapat berikatan dengan  p300 dan protein pRb terkait secara simultan, yang berpotensi untuk memfasilitasi interaksinya. Hilangnya fungsi pRb juga menginduksi p53 melalui peningkatan ekspresi protein tumor repressor, yaitu p14ARF, yang mencegah MDM2 untuk mengendalikan degradasi p53. Hal ini merupakan mekanisme E1A yang menyebabkan terjadinya apoptosis sel primer.

Pada saat E1B berikatan dengan p53, supressor tumor yang lain terlibat dalam pengendalian siklus sel. Region E1B mengkode 2 protein yang tidak berkaitan dengan sekuen asam amino, dengan berat molekul masing-masing 29 KDa dan 58 KDa, namun keduanya mempunyai fungsi anti-apoptotik. Kedua protein bekerja secara independen dan dengan mekanisme yang berbeda. Protein 58 KDa secara langsung menghentikan aktivitas tumor supressor, p53, dan merupakan protein mutasi paling umum dalam kanker manusia. Protein p53 merupakan faktor transkripsi berupa regulasi negatif untuk proliferasi sel. Protein p53 tidak konstitutif terlibat dalam siklus sel, tetapi teraktivasi dalam menanggapi kerusakan DNA. Pada saat p53 membentuk kompleks dengan protein E1B-58K, protein tersebut akan mengalami deaktivasi transkripsi. Mutan protein E1B-58K yang tidak mampu membentuk kompleks dengan p53, juga tidak mampu bekerjasama dengan E1A untuk mentransformasi sel dalam kultur. Sedangkan protein 19 kDa menghambat apoptosis melalui mekanisme yang sama dengan protein bcl-2 pada manusia.

Adenovirus juga mengkode beberapa protein yang berperan dalam mekanisme apoatosis immune-mediated. Pada umumnya mekanisme ini diatur oleh unit transkripsi dari E3. Terdapat 7 jenis protein E3. Protein E3-gp 19 K (glikoprotein dengan berat molekul 19kDa dikode oleh unit transkripsi E3) merupakan pertahanan pertama untuk melawan CTL, berikatan dengan semua haplotype antigen kelas I manusia dan ada pada semua Adenovirus respiratori. Protein ini tidak dimiliki oleh  Adenovirus yang menginfeksi traktus gastrointestinal, sehingga untuk mengatasi adanya antigen kelas I dengan cara merepresi tingkat transkripsi yang diperantarai oleh protein Ad-coded E1A. Protein lain yang dikode E3 disebut RID dan E3-14.7 K berfungsi menghambat beberapa induksi killing pathway oleh CTL pada sel yang terinfeksi, selanjutnya terlibat dalam apoptosis melalui perforin-granzyme pathway. Oleh sebab itu E3 disebut sebagai gen ’tersembunyi’ yang memungkinkan Adenovirus menginvasi respon immun inang. Pengamatan menunjukkan bahwa pada Adenovirus terdapat adanya pemisahan perangkat seluler dan perubahan lingkungan intraseluler untuk replikasi virus yang sesuai, sehingga mempengaruhi fungsi seluler. Transformasi jarang terbentuk setelah infeksi. Dasar untuk onkogenesis tidak jelas, namun diketahui bahwa Ad12 E1A menghambat ekspresi MHC kelas I, yang memungkinkan tumor lolos dari destruksi oleh CTL.

Replikasi Adenovirus telah dipelajari secara ekstensif melalui in vivo (sel yang terinfeksi mutan) dan in vitro (ekstrak nukleat). Terdapat protein yang dikode oleh virus dan terlibat dalam replikasi DNA, yaitu :

1. TP (Ad DNA Pro) bertindak sebagai primer untuk inisiasi sintesis
2. Ad DBP bertindak sebagai protein yang berikatan dengan DNA
3. Ad DNA Pol bertindak sebagai DNA polimerase dependen dengan berat molekul 140 kD

Selain itu terdapat protein seluler dalam nukleus yang berpartisipasi dalam replikasi genom (NF I, NF III, Topoisomerase I). Genom Adenovirus mempunyai ujung yang  berulang terbalik (ITR) sekitar 100 bp. Diantara ITR terdapat sekuen DNA cis-acting yang berperan sebagai ORI (Origin of  DNA Replication). Pada setiap ujung 5’, terdapat protein terminal (TP) yang terikat secara kovalen yang berfungsi sebagai komponen cis-acting tambahan untuk ORI. Diantara terminal 51 bp dari 2 genom Adenovirus, terdapat 4  region yang berperan untuk inisiasi replikasi ; Terminal 18 bp berperan sebagai ORI minimal dan sekeun ini dapat secara langsung membatasi inisiasi hanya dengan melibatkan 3 protein viral dalam replikasi, yaitu protein proterminal (pTP), DNAS polimerase (pol) dan DNA binding protein (DBP). Dua faktor transkripsi seluler ; faktor nuklear I (NF I) dan faktor nuklear III (NF III) diperlukan untuk efisiensi tingkat replikasi. Terkecuali untuk Adenovirus 4 melakukan replikasi secara efisien tanpa NF I dan NF III. Faktor seluler yang lain, topoisomerase , dibutuhkan untuk proses elongasi secara lengkap. Tahap dalam replikasi DNA Adenovirus sebagai berikut :

1. Genom virus diselubungi oleh DBP
2. Protein bekerjasama dengan faktor transkripsi seluler, NF I yang berikatan dengan sisi pengenalan diantara ORI, terpisah dari 1-18 bp oleh spacer region
3. NF III berikatan dengan sisi pengenalan spesifik antara nukleotida 39 dan 48
4. Interaksi protein, antara NF I dan Pol dan antara pTP dan NF III membantu pTP-pol heterodimer membentuk kompleks preinisiasi.
5. Interasi antara heterodimer dan pasangan basa 9-18 spesifik dan sequen DNA meyakinkan penempatan posisi yang benar dan kompleks yang terbentuk stabil terhadap interaksi di antara pTP –pol dan genom yang berikatan dengan TP
6. Replikasi DNA kemudian diinisiasi oleh mekanisme priming protein yang berikatan secara kovalen dibentuk diantara grup alfa-fosforil dari residu terminal, dCMP dan grup beta-hidroksil dari residu serin dalam pTP, reaksi yag dikatalis oleh pol yang bertindak sebagai primer untuk sintesis untai template.
7. Pemasangan basa dengan triplet GTA kedua dari untaian template mengarahkan sintesis trinukleotida pTP, yang kemudian melompat kembali 3 basa, ke pasangan basa dengan triplet pertama (juga GTA) dan sintesis kemudian berlangsung melalui penggantian untaian non-template.
8. NF I berdisosiasi sebagai nukleotida pertama yang berikatan setelah reaksi inisiasi. Disosiasi pTP dari pol dimulai pada saat trinukleotida pTP terbentuk dan hampir lengkap pada saat 7 nukleotida telah disintesis.
9. NF III terdisosiasi pada saat garpu replikasi melewati sisi pengikatan NF III.

Walaupun 2 komponen sistem replikasi Adenovirus terkristalisasi secara individu, yaitu DBP dan POU (NF III DBD), namun model struktur untuk kompleks preinisiasi secara keseluruhan masih dalam tahap penelitian lebih lanjut.

Daftar Pustaka

Kenny MK, Lisa AB, and Jerard H. Initiation of Adenovirus DNA Replication. Journal of Biological Chemistry. 1988. Vol 263 (20).

Anonim. 2005. Page Weaver Production. http //: www.Adenovirus/replication.html.

Adenovirus : Update on Structure and Function. J. Gen. Virol. 2009. 90(1) : 1-20.

Roulston, A. Viruses and Apoptosis. Ann. Rev. Microbiol. 53 : 577-628.

Yewdell JW and Bennink JR. Mechanisms of Viral Interference with MHC Class I Antigen Processing and Presentation. Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. Vol. 15 : 579-606.