Peran gen T- DNA ORF 8 Ri-plasmid

T- DNA ORF 8 Ri-plasmid tipe cucumorpine Agrobacterium rhizogenes terlibat dalam respon terhadap auksin pada tembakau transgenik (Quartsi et al., 2004)

Berbagai Ri plasmid selain pRi A_4, yang ditemukan pada A. rhizogenes menunjukkan adanya perbedaan organisasi genetik. Pada plasmid pRi 2659 dan pRi 8196, gen T-DNA rol A, rol B, dan rol C (ORFs 10, 11, dan 12) menunjukkan kemampuan untuk menginduksi proliferasi akar. Conserved sequence dari T-DNA Ri  plasmid bukan gen rol, melainkan ORF 8, 13, 13 a dan 14. ORF 13 dan 14 berperan dalam induksi akar (model percobaan menggunakan potongan wortel), dalam kondisi yang tidak mendukung pembentukan akar, yang diinfeksi dengan Agrobacterium pembawa gen rol ABC. Hal ini mengindikasikan bahwa gen selain rol ABC juga esensial untuk menginduksi hairy root, tergantung tipe dan spesies sel inang. ORF 13 dari pRi 8196 dan pRiA4 menyebabkan terjadinya perubahan perkembangan morfologi tembakau transgenik, pada saat diekspresikian dengan promoter CaMV 35S RNA. ORF 8 dari pRi A4 diekspresikan dalam jaringan hairy root tembakau.  Perbandingan sekuen deduksi peptida – asam amino menunjukkan adanya persamaan yang signifikan pada pRi A4 ORF 8 mungkin terlibat dalam respon terhadap auksin, terkait dengan karakteristik protein :

1.  Protein Tms1 yang dikode gen tms 1 dari T-DNA A. tumefaciens dan protein IaaM dari Pseudomonas savastanoi.

2.      Produk rol B A. rhizogenes dan protein yang diduga dikode gen 5 T-DNA A. tumefaciens

IaaM dan Tms I triptofan monooksigenase mengkatalisis reaksi pembentukan indole-3-asetamide (IAM) yang selanjutnya diubah menjadi produk gen tms2 yaitu IaaH. Gen yang mengkode IaaH berlokasi pada T-DNA A. rhizogenes pada genom patogen tumbuhan P. savastanoi. Hal ini menujukkan bahwa gugus N-terminal dari protein ORF 8 berhubungan dengan protein rol B. Rol B menginduksi perubahan respon terhadap auksin dalam jaringan. Kemiripan sekuen ORF 8 diduga terlibat dalam katalisasi pembentukan senyawa auksin yang mirip dengan indole-3 laktat (ILA), sehingga berimplikasi pada perubahan respon terhadap auksin. Produk gen pRiA4 ORF8 mempunyai aktivitas protein triptofan 2-monooksigenase, namun dapat berubah secara kontroversial menjadi tidak mampu mensintesis IAM.

         Kajian tentang pengaruh ORF 8 dari Ri 2659 A. rhizogenes terhadap morfogenesis dan respon jaringan terhadap auksin pada tembakau transgenik dijelaskan sebagai berikut. 

           Terlebih dahulu perlu dilakukan konstruksi plasmid berupa gen Uid A ORF 8, dari pJBORF8 berisi daerah regulator ORF 8 yang difusikan ke gen Uid A dari PB1101-2 untuk membentuk plasmid PJB78-GUS CaMV 35 S RNA (437 bp), yang diamplifikasi dari plasmid pB1121. Selanjutnya plasmid ditransformasikan ke daun tembakau melalui mediasi Agrobacterium strain LBA 4404, germinasi dan kultur jaringan, pengujian akitivitas enzym GUS, pengamatan dengan mikroskop elektron transmisi, dan pencarian homologi.

Hasil penelitian menunjukkan, A. rhizogenes strain cucumopine 2659 hanya membawa T-DNA yang tidak mengandung gen Aux. T-DNA ini mempunyai struktur homologi tinggi, baik pada pRi 8196 T-DNA dan pRi A4 TlDNA. ORF 10, 11, dan 12 (gen rol A, B, C) yang berperan penting untuk menginduksi hairy root, tidak bersifat homolog dalam biosintesis auksin dan tidak menunjukkan karakteristik conserved sequence. ORF 8 merupakan salah satu conserved sequence di antara 3 T-DNA A. rhizogenes yang berbeda.  Hal ini menunjukkan ORF 8 diduga berperan penting untuk menginduksi hairy root secara alami. Protein ORF 8 mempunyai struktur khusus yang mungkin merupakan fusi protein dengan 2 domain. Perbandingan sekuen asam amino menunjukkan bahwa domain C-terminal dari pRi 2659 ORF 8 mempunyai homologi yang signifikan terhadap tms 1 yang dikode oleh T-DNA A. tumefaciens (31.9%). Domain C-terminal menunjukkan FAD binding site, sebagai sebuah karakteristik fungsional dari protein t2m yang mengkatalisis dekarboksilase oksidatif dari triptofan ke IAM. Struktur ini juga terdapat pada protein IaaM P. savastanoi dan ORF 8 dari pRi A4. Protein ORF 8 homolog dengan protein IaaM, mempunyai aktivitas triptofan 2-monooksigenase rendah. Penelitian mengenai produksi IAM dalam tanaman tembakau mengekspresikan ORF 8 dari pRi 2659. T-DNA dari plasmid terdiri dari satu blok dan tidak mempunyai gen Aux (IaaM dan IaaH) yang mengkode sintesis auksin. Hal ini mengarah pada dugaan bahwa ORF 8 berperan penting pada tahap awal biosintesis auksin, sementara konversi IAM ke IAA tergantung pada gen spesies inang. Selanjutnya gen rol T-DNA dari strain cucupomine menstimulasi pertumbuhan akar, sementara pengaruh gen rol dari strain agropine terhadap stimulasi akar teramati pada saat ada auksin eksogenus.

N-terminal dari pRi2659 ORF 8 mirip dengan produk rol B dan T-DNA lain dari beberapa Ti plasmid. Gen pRi 2659 35 S-ORF 8 secara jelas bersifat resisten terhadap konsentrasi auksin pada kecambah tembakau yang menghambat germinasi dan post-germinasi pada wild type.

    Kotiledon kecambah transgenik menunjukkan fenotipe bentuk yang lurus dan lanceolated, namun mampu mengekspresikan enzim beta-glukoronidase (GUS). Hal ini juga mengindikasikan bahwa transkripsi ORF 8 menginduksi auksin.