Semliki Forest Virus sebagai vektor terapi gen

1. Struktur genom dan siklus hidup

Virus Semliki Forest (SFV) merupakan anggota genus Alphavirus, famili Togaviridae. Virus ini menginfeksi hewan-hewan vertebrata dan melangsungkan replikasi pada sitoplasma sel inang yang diinfeksi. Virus ini dicirikan dengan genom RNA positif untai tunggal, yang tersusun dari 12.000 nukleotida. Genom tersusun dari ujung 5’ (capped) dan poliadenilasi pada ujung 3’. Genom virus ini secara langsung berperan sebagai mRNA yang mengkode protein polisistronik yang membelah menjadi 4 protein non struktural (nsP1-4). Protein ini berasosiasi dengan faktor seluler dan membentuk kompleks replikase. Kompleks ini memediasi replikasi genom dengan mengubah untai positif menjadi untai negatif yang sangat panjang dan efisien untuk menghasilkan RNA genomik yang baru dan subgenom RNA yang kedua dalam proses autokatalitik. Subgenom RNA mengkode protein struktural yang menjadi prekursor nukleokapsid. Replikasi virus ini sangat efisien, yaitu mencapai 10⁵ virion per sel, dengan dibantu oleh perangkat replikasi dari sel inang (Machida, 2003).

2. Strategi pembuatan vektor SFV untuk terapi gen                

Pada pembentukan protein rekombinan SFV, gen viral yang bersifat struktural diganti oleh transgen. Setelah transfeksi atau elektroporasi ke sel traget, molekul RNA bereplikasi dan memproduksi protein rekombinan dalam jumlah yang banyak. Sistem SFV rekombinan juga termasuk konstruksi tambahan yang menyediakan protein struktural in trans, yang memfasilitasi produksi rekombinan partikel virus untuk transfer gen yang lebih efisien (Lundstorm et al., 2001).

Tahap pembuatan vektor SFV untuk terapi gen menurut Machida (2003) meliputi :

1.      Pembuatan plasmid rekombinan SFV

Vektor plasmid pSFV1 dan pSFV3 yang terdiri dari multiple cloning site minimal, dengan sisi pemotongan enzim restriksi Sma I, Xma I, dan Bam H1. Template Plasmid dilinearkan dengan Spe I sebelum sintesis RNA.

2.      Sintesis RNA SFV

Untuk menghasilkan virus transgen SFV rekombinan, 2 RNA SFV yaitu transgen SFV dan SFV-helper 2 harus disintesis secara in vitro menggunakan plasmid sebagai template. Sintesis RNA menggunakan RNA polimerase SP6 dan menghasilkan RNA dengan ujung 5’, seperti mRNA di dalam sel inang. Karena transkripsi oleh SP6 polimerase menghentikan sintesis, maka template plasmid harus dilinearkan dengan terminasi 3’RNA terlebih dahulu.

3.      Pembentukan Virion SFV

Virion SFV diproduksi dalam sel BHK-21, menggunakan elektroporasi simultan dari transgen SFV dan SFV-helper 2. Produksi selama 24 jam menghasilkan virion dengan kondisi inaktif karena modifikasi protein kapsidnya dan menjadi aktif dengan perlakuan kimotripsin

4.      Titrasi stok SFV

Apabila vektor mengandung gen marker yang dapat dideteksi, seperti lac Z atau GFP, vektor dapat dititrasi melalui transduksi sel BHK-21 dengan seri pengenceran virus melalui warna biru pada sel setelah pengecatan XC-gal (lac Z)atau adanaya fluoresen pada flow sitometer (GFP). Apabila vektor tidak membawa marker gen yang dapat dideteksi, titer virus dibedakan dengan metode dot-blot virion utuh dan memebutuhkan jumlah titer yang lebih banyak. Pada saat hibridisasi signal dari strok SFP yang dihasilkan dibandingkan dengan stok refereansi, maka titer atau jumlah genom RNA dapat diperkirakan.

5.      Transduksi Rekombinan  virus SFV ke sel target

Sel target ditumbuhkan dalam medium pertumbuhan yang sesuai. Virus transgen SFV diaktivasi dengan penambahan kimotripsin, CaCl₂, kemudian diinkubasikan. Protease virus diinaktivasi dengan Aprotinin, kemudian disimpan dalam es. Selanjutnya sel target dipisahkan dari medium dan dicuci dengan PBS yang mengandung ion Mg dan Ca. Kemudian virus rekombinan dimasukkan dalam plate sel target hingga hampir menutupi permukaan sel dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37^oC. Selanjutnya dilakukan analisis ekspresi transgen. 

     3. Potensi SFV sebagai vektor terapi gen

SFV sebagai anggota dari Alphavirus berpotensi sebagai vektor virus terapi gen. SFP mempunyai kisaran inang yang luas, mampu bereplikasi secara efisien di dalam sitoplasma sel inang, mempunyai kapasitas gen yang dapat disisipkan sebesar 5 Kb, dan kemampuan menghasilkan protein rekombinan dalam jumlah banyak. SFV  mempunyai tingkat ekspresi transgen yang cepat, ekspresi temporal, dan destruksi sel target yang dapat dikendalikan. Stok partikel virus yang digunakan untuk menginfeksi kultur cell line dapat diaplikasikan secara in vivo tanpa purifikasi.. Namun untuk ekspresi jangka panjang, penggunaan SFV kurang sesuai sebab data hibridisasi in situ menunjukkan adanya perubahan karakteristik ekspresi gen (Piver et al., 2004).