Vektor Terapi Gen - Lentivirus

1. Struktur genom dan siklus hidup

Lentivirus merupakan anggota subkelas Retrovirus, famili Retroviridae. Lentivirus mempunyai tiga gen utama yang mengkode protein viral, yaitu 5’-gag-pol-env-3’. Protein hasil ekspresi gen pol berupa enzim viral yang terlibat pada awal tahap replikasi adalah reverse transkriptase dan integrase. Reverse transkriptase (RT) merupakan DNA polimerase viral yang bersifat RNA-dependent. Enzim tersebut digunakan oleh genom RNA viral untuk sintesis kopi cDNA. RT juga mempunyai aktivitas RnaseH untuk mendestruksi template RNA (Machida, 2003).

Lentivirus bersifat lebih kompleks dibandingkan Retrovirus, sebab mempunyai 6 jenis protein asesoris, yaitu : Tat, Rev, Vpr, Vpu, Nef, dan Vif. Komposisi gen asesoris berbeda pada setiap tipe Lentivirus tergantung pada produk yang dihasilkan untuk regulasi sintesis dan pemrosesan RNA viral, serta fungsi replikatif yang lain. Adanya protein integrase dan protein Vpr yang terdiri dari sekuen signal berperan penting untuk proses lokalisasi di dalam nukleus. Integrasi virus dengan sel inang melalui protein  Vpr yang berikatan secara langsung dengan kompleks pori nukleus, kemudian protein masuk melalui membran nukleus, menuju nukleus dan melangsungkan reverse transkripsi untuk menghasilkan cDNA. Selanjutnya integrase akan berikatan dengan cDNA viral yang dihasilkan oleh RT dan DNA inang. Aktivitas LTR oleh integrase diawali dengan insersi genom viral ke dalam inang DNA. Walaupun transmisi dihasilkan melalui partikel infektif, namun Lentivirus mampu menginfeksi sel tetangga yang kontak secara langsung dengan sel inang, tanpa membentuk partikel ekstraselluler (Buchschacher et al., 2000).

2. Strategi pembuatan vektor Lentivirus untuk terapi gen

Lentivirus mempunyai kemampuan untuk menginfeksi sel yang berproliferasi maupun tidak berproliferasi. Ekspresi transgen diatur oleh promoter Cytomegalovirus yang direkayasa secara internal dan inaktif. Hal ini dapat menyebabkan respon inflamatori pada saat injeksi vektor ke sel target (Buchschacher, et al., 2000)

Lentivirus mempunyai karakteristik periode inkubasi yang lama. Virus ini mampu mengirimkan sejumlah informasi genetik secara signifikan ke dalam DNA sel inang, sehinggga menjadi salah satu metode yang efisien untuk vektor terapi gen. Beberapa contoh Lentivirus antara lain HIV (Human Immunodeficiency virus), SIV (Simian Immunodeficiency Virus), dan FIV (Feline Immunodeficiency Virus). Vektor lentiviral HIV telah diuji keamanannya, dengan proses penghilangan gen-gen regulatori yang bersifat non-esensial, sehingga terbentuk mutan vpr dan vif yang mampu menginfeksi neuron, sel otot, dan sel hati (Schmidt, 1999).

HIV tipe I (HIV-1), dalam pengembangannya sebagai vektor dan pengemasan cell line  lebih sulit dibandingkan retovirus onkogenik yang lain. Hal ini disebabkan propagasi HIV-1 tidak hanya membutuhkan protein Gag, Pol, dan Env, tetapi juga gen tat dan rev. Pengemasan cell line yang sulit juga disebabkan oleh toksisitas dari HIV-1 yang tinggi. Oleh sebab itu, berbagai vektor HIV-1 dikonstruksi melalui penghilangan gen env pada genom viral, dan menggantinya dengan insert berupa marker gen yang diekspresikan oleh promoter viral heterolog internal. Konstruksi ini menghasilkan ekpresi semua gen HIV, kecuali env, sehingga selubung viral berperan dalam propagasi vektor. Penggunaan glikoprotein selubung HIV memungkinkan vektor ditargetkan pada limfosit T helper, tetapi terbatas pada sel yang tidak dapat terinfeksi dan menghasilkan konsentrasi titer yang rendah.(Anson, 2004)

 Protein selubung viral Retrovirus yang lain mampu menggantikan selubung HIV, antara lain glikoprotein selubung MLV amfotropik atau G-protein virus stomatitis vesikuler (VSV-G) yang mampu menginfeksi berbagai tipe sel. Penggunaan VSV-G juga menghasilkan jumlah vektor yang lebih tinggi dengan kestabilan partikel vektor virus yang lebih tinggi. Kedua virus tersebut merupakan onkoretroviral vektor yang semua gen viralnya (sekuen trans) dihilangkan. Bagian yang tertinggal hanyalah sekuen cis yang penting saja. Gen marker diekspresikan secara langsung dari LTR HIV atau dari promoter internal. Ekspresi gen yang direkayasa dari LTR HIV (contohnya gen tat) memungkinkan ekspresi gen untuk berada pada sel yang mengekpresikan Tat secara spesifik. Namun penggunaan promoter internal meningkatkan tipe sel yang dapat diekspresikan gen marker (Machida, 2003).

Untuk membuat vektor terapi gen lentiviral, gen terapeutik diklon pada sekuen vektor yang dibatasi oleh LTR dan ψ sekuen pada HIV. LTR berperan penting untuk integrasi gen terapeutik ke dalam genom sel traget pada kromosom, seperti LTR dalam HIV berintegrasi dengan kopi DNA untai ganda dari virus. Sekuen ψ berperan sebagai sekuen signal pengemasan RNA dengan gen terapeutik di dalam virion. Protein viral yang membuat selubung virus berperan penting dalam pengemasan cell line. Namun protein ini tidak berada pada sekuen LTR dan sekuen ψ, sehingga tidak terkemas di dalam virion. Akibatnya partikel virus yang dihasilkan mempunyai replikasi yang rendah dan vektor tidak mampu meneruskan infeksi ke inang dan mengekspresikan protein terapeutiknya (Anson, 2004).   

  Vektor Lentivirus sangat berguna untuk mempelajari siklus tunggal replikasi HIV dan mempelajari penyusunan sistem vektor yang lebih baik dibandingkan onkoretroviral. Keuntungan vektor Lentiviral yaitu efisiensi infeksi yang tinggi pada sel yang membelah maupun tidak membelah, ekspresi transgen yang stabil dalam jangka waktu yang lama, dan immunogenisitas yang rendah. Nmun karena tidak terdapat pengemasan cell line untuk  HIV, maka propagasi vektor tergantung pada kotransfeksi vektor dan konstruksi plasmid DNA helper. Sehingga kelemahan vektor ini jumlah titer yang dihasilkan lebih rendah dan meningkatkan resiko untuk membentuk rekombinan virus replikasi-kompeten (Buchschacher, et al., 2000)